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本发明公开了一种醛酮还原酶KmAKR突变体、工程菌及其在不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯中应用,所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第164位、第182位、第232位或第266位进行单突变或多突变获得的。本发明构建的突变体单位菌体酶活较对照组增加了0.24~0.30倍;全细胞下的T-(50)~(15)值则提高了0.6~6.3℃,最大底物投料量可达到400g/L,底物转化率大于99%,de-(p)值始终保持在99.5%以上,时空产率达到449.2g/L/d。