本发明涉及一种制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法,该制备方法采用含尿苷的料液为底物,加入具有尿苷激酶和聚磷酸激酶活性的大肠杆菌细胞破碎液、六偏磷酸钠、硫酸镁和少量ATP,在pH 8.0,温度30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸。在上述偶联催化反应体系中,尿苷激酶负责催化尿苷和ATP生成尿苷酸,同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP。聚磷酸激酶负责催化六偏磷酸钠和ADP形成ATP,从而实现反应中ATP的再生。本发明提供的尿苷酸生产方法具有原料价格低廉,周期短,操作简便,绿色环保,产率高的优点,具有良好的工业应用价值。