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本发明涉及一种低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法。制备步骤:将自由基引发剂偶氮二异丁腈加入低共熔溶剂/离子液体中,超声分散后,加入功能单体甲基丙烯酸、共聚单体甲基丙烯酸丁酯、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯,超声溶解后注入毛细管中,热引发合成整体柱,用三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP‑HCl)试剂使胰蛋白酶中的双硫键还原为巯基,加入过硫酸铵和N,N’‑亚甲基双丙烯酰胺制备酶衍生液,在室温下与整体柱反应固定到整体柱表面,进行酶解蛋白。整体柱结构稳定,对酶活性影响较低,可作为重复利用的新型酶反应器酶解蛋白溶液。本发明采用原位聚合法在毛细管内直接聚合,合成方法简便易行,操作简单,聚合时间较短,成本低廉,具有广泛的应用前景。