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本发明属于药物制剂与临床药学领域,涉及一种具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和应用。该抗体核酸药物偶联物具有A‑m‑X‑Y‑B所示结构,其中,A为抗体,X为通过短肽m与所述A共价连接的穿膜肽,Y为与所述X共价连接的柔性链段,B为与所述Y共价连接的核酸药物。本发明的抗体核酸药物偶联物具有普适性,可用作多种核酸药物传递系统,也为近一步的临床转化提供了理论支持和技术参考。此外,本发明的抗体核酸药物偶联物也可用作体外筛选药物。根据不同药物研究中体外筛选目的的不同,上述核酸偶联物可以作为阳性对照或阴性对照。