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本发明提供一种双阳离子咔唑荧光探针的制备方法,该方法步骤为在磁力搅拌条件下,向反应瓶中依次加入1mmol的N-烷基-3,6-二醛基咔唑、2-3mmol的苯并吲哚盐、20-50ml的混合溶剂以及无机盐催化剂;在20-25℃下反应12-24小时;反应完毕,反应液抽滤得到粗品;粗品用洗涤溶剂进行搅拌洗涤1-3次,再抽滤、干燥得到双阳离子咔唑化合物。有益效果是以饱和脂肪醇和水混合物作为溶剂,溶剂廉价易得,催化剂成本低廉,制备方法操作简单,转化率高无需使用柱层析进行分离以及昂贵醋酸钯催化剂,减少环境污染。双阳离子咔唑荧光探针的制备方法得到的产品采用高效液相检测最含量大于96%。