[00107865]禾草种带内生真菌镜检前种子一体化处理装置

技术领域

本实用新型涉及一种大批量禾草种带内生真菌镜检前种子一体化处理装置， 它集装样，软化，洗涤，染色和加热一体化，大大缩减了镜检前种子处理时间、 统一了样品量、强化了染色效果和试剂的循环利用。

背景技术

禾草内生真菌(grass endophyte)是指在禾草体内度过大部分或者全部生命周 期，但却不会引起禾草外部显示任何病害症状的一大类真菌。从最初发现黑麦草 (Loliumperenne)和高羊茅(Festuca arundinacea)引起家畜中毒到后来其携带的内生 真菌被发现，以及进一步的研究证实，内生真菌的存在不但导致家畜中毒而且能 显著提高宿主在群落中的竞争力，也因禾草内生真菌的这种重要生理和生态作 用，使其逐步成为国内外研究的热点之一，这也给内生真菌检测技术的发展提供 了契机。目前禾草内生真菌的检测方法有镜检和分离检测、酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked Immunosorbent AssayELISA)、全基因组测序、实时荧光 PCR 法 (Realtime PCR)和利用次生代谢物间接检测。

1.镜检：(1.)用 NaOH 种皮软化；(2.)用自来水洗涤；(3.)染色；(4.)镜检。

2.分离检测：用酒精浸泡 10min，NaClO 浸泡 8min，再用无菌水反复冲洗数 次，用滤纸吸干后，放置 PAD 培养，内生真菌在 PDA 培养基生长一般需要一个 礼拜。

3.酶联免疫吸附测定法：(1.)待检标本提取(2.)用已知特异性抗体包被固相载 体；(3.)加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的 物质；(4.)加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去 未结合的酶标抗体；(5.)加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光 密度值进行定量测定。

4.全基因组测序:提取菌丝 DNA，再进行测序。

5.实时 PCR，该技术是在常规 PCR 的基础上加入了荧光特殊物质来标记产物， 分析产物，最后通过标准曲线计算其初始浓度。

6.利用次生代谢物间接检测：生物碱的提取，目前对于生物碱的检测主要是 运用不同的色谱检测方法：高效液相色谱法(HPLC)，质谱法(MS)和气相色谱法 (GC)。HPLC 检测生物碱时需要选择适合该生物碱分离的流动相和检测器，不同种 类的生物碱，其选择的流动相 pH 值和浓度不同。

从上述可以看出，镜检跟分离检测相比所需时间要短，可以大批量检测；与 酶联免疫吸附测定法相比简单易操作、耗时短、经济实惠；与全基因组测序和实 时 PCR 相比经济实惠，适合大批量检测；与利用次生代谢物间接检测耗时短、经 济实惠、简单易操作。但这种简单易操作、耗时短、经济实惠的方法在装样，软 化，洗涤，染色和加热方面却没有与之相关的装置，平时人们用离心管代替。而 用离心管存在很多问题：(1.)装样时，没有参考标准，因人而异，造成种子的浪 费和软化，染色的不彻底。(2.)用 NaOH 对禾草种子进行软化处理后，需要将软化 液吸取干净，由于针管头细小，在吸取过程容易造成针管堵塞，需要多次反复吸 取，耗费大量的时间。(3.)由于禾草种子小，在洗涤时会使部分种子外流，造成 浪费，同时需要反复清洗，尽量把 NaOH 溶液清洗干净，否则会对染色造成影响， 这个过程对大批量的禾草种子来说显得异常繁琐和浪费时间。(4.)染色时需要加 热，需要把离心管移到水浴锅中加热，在过程中可能混淆和洗掉原先的标记，造 成实验的失败，同时要把染色完的试剂倒掉，造成试剂的浪费，对环境造成一定 的污染。

实用新型内容

为了解决上述装置中存在的问题，本实用新型提供了一种集装样，软化，洗 涤，染色和加热的禾草种带内生真菌镜检前种子一体化处理装置，大大缩减了镜 检前种子处理时间、简化了其软化液和洗涤液的吸取过程。