[00107899]一种检测绵羊 KITLG 基因的单核苷酸多态性的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以绵羊的功能基因的单核苷酸多态性(SNP) 作为分子遗传标记，特别涉及绵羊 KITLG 基因的单核苷酸多态性及其检测方法。

背景技术

在动物育种中，人们期望通过对生长、繁殖等性状密切相关，并且与数量性 状紧密连锁的 DNA 标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从 而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(Molecular Mark-Assist Selection,MAS)， 该技术是借助 DNA 分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性 状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行 新品种选育。

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异， 这些差异是由于染色体中 DNA 等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的 替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是由美国麻省理工学院 的人类基因组研究中心的学者 Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基 因组 DNA 序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNP 作为新的 遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP 是基因 组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的 90％以 上。SNP 与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于 1％的此种变异被称 为突变，而只有频率大于 1％时才被称为单核苷酸多态性。它的变异形式有：颠 换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型 的碱基变异的 SNPs 约占 2/3。

根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下 3 类：基因编码区单 核苷酸多态性(Coding-region SNPs,cSNPs)、基因周边单核苷酸多态性(Perigenic SNPs,pSNPs)以及基因间单核苷酸多态性(Intergenic SNPs,iSNPs)。

研究表明，位于编码区内的 cSNP 比较少。基因编码区内的 cSNP 又可分为 2 种：一种是编码区内的同义 cSNP(Synonymous cSNP)，即 SNP 所致编码序列的改 变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同 义 cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从 而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。

由于 SNPs 是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中， SNPs 可能是由 2 个、3 个或 4 个等位基因构成，但实际上 3 个或 4 个等位基因的 SNPs 很罕见，故 SNPs 通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用 几种不同的路线来发现 SNPs：即 DNA 序列测定方法、聚合酶链反应—单链构象 多态(Polymerase Chain Reaction-SingleStrand Conformation Polymorphism， PCR-SSCP)与 DNA 测序结合法、等位特异性 PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、 引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些 SNP 检测技术中，DNA 序列测定法是 最为准确的 SNP 检测方法，但是，其检测费用昂贵，且需要有 DNA 测序仪等大 型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA 序列 测定法不是一种应用于生产实际的理想 SNP 检测方法；当然，利用 PCR-SSCP 与 DNA 测序结合法检测 SNP 可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP 的实验过程 比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的 SNP 检测手段；AS-PCR 方法作为一种新型的 SNP 检测方法，在未来的应用领域中具有 非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位 点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点； 而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测 SNP 位点，需要平板读数仪、基因芯 片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不 强。

限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(Restriction Fragment LengthPolymorphism-Polymerase Chain Reaction，RFLP-PCR)方法是一种检测 SNP 的有效技术，在发现 SNP 位点后设计上下游引物用限制性内切酶进行切割，然后 进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别 SNP 位点。RFLP-PCR 方法不 仅具有 DNA 测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点， 而且所检测的序列位点无特殊性要求。

KITLG(KIT Ligand，KL 或 KitL)是一种分泌生长因子，又被称为干细胞因子 (StemCell Factor，SCF)，肥大细胞因子(Mast Stem Cell Factor，MCGF)或 Steel 因子 (SteelFactor，SLF)，属于酪氨酸激酶受体家族。KITLG 由 Mgf cDNA 编码，由 284 个氨基酸组成。KITLG mRNA 主要在卵泡的颗粒细胞中表达)。KITLG 通过其受体 KIT 信号影响卵母细胞与颗粒细胞之间的相互作用。颗粒细胞中的 KITLG 和卵母 细胞中的 KIT 之间的互作对动物繁殖是不可或缺的。KITLG 在原始生殖细胞 (Primordial Germ Cells，PGCs)的生存、增殖、迁移以及卵泡的发育中发挥作用。 KITLG 在卵泡发育中也起很重要的作用。KITLG 结合 KIT 诱发 PI3K 通路在其它多种 信号通路协调下传导信息，激活卵母细胞，促进卵母细胞的生长和分泌作用。虽 然有关 KITLG 基因在动物繁殖方面的作用的研究取得了一些进展，但是在绵羊上 的研究报道较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测绵羊 KITLG 基因的单核苷酸多态性的方法及 其应用，利用 PCR-RFLP 方法针对其基因位点上的突变进行检测，提前淘汰劣势 个体，加快高繁种羊群体的建立。