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本发明涉及一种单染色体水平的甲基化测序方法,其包括以下步骤:(1)培养与收集待测样本中的淋巴细胞;(2)显微注射挑取单细胞并分离染色体以获得单倍体;(3)将单倍体进行稀释,用Bisulfite处理,将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U,进行PCR扩增后变成T,与原本具有甲基化修饰的C碱基区分,高通量测序技术进行甲基化测序。本发明提供的方法具有成本低、试验方法简单、耗时周期短以及设备成熟等优点,可广泛应用于癌症的早期诊断和鉴别诊断的临床研究中,其具备全基因组和单细胞水平甲基化检测方法的优势并可确定甲基化信息的遗传来源,从而可广泛应用于表观遗传的研究。