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本发明提供了一种血清多肽组学的质谱检测方法,包括样本制备、数据非依赖性质谱采集及数据处理;该方法针对血清多肽组学样本发展了数据非依赖性质谱采集方法,通过对血清样本的预分析实验获取样本的母离子分布情况,由此确定最优的可变隔离窗口;通过对多肽组学样品制备方法、质谱采集方法和数据处理方法的优化,各步骤各条件相互配合,最终实现多肽检测数目、鉴定重现性和定量准确性的显著提高;本发明方法具有高通量、高重现性和高准确性的特点,适合于大规模临床血清样本的分析及疾病标志物的检测,具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。