[00111310]Stathmin在食管鳞癌中的表达及干扰其表达对肿瘤生物学行为的影响

1.任务来源： 河南省科技攻关计划项目（102102310455） 2.应用领域和技术原理： 食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,尤其在中国河南的林县,食管癌的发生率和死亡率均较高。国内食管癌常见类型仍是食管鳞癌,侵袭性强,预后差,进展迅速且易复发。肿瘤细胞的快速分裂、增殖及迁徙依赖于细胞微管系统动力不稳定性,微管调节蛋白表达的紊乱可以破坏有丝分裂、终止恶性细胞的生长。Stathmin是一种新发现的微管不稳定蛋白,通过调节微管系统的动力学平衡控制细胞周期,并以此改变细胞的增殖、分化及活性等生物学行为。该课题采用原位杂交和免疫组化方法检测食管鳞癌细胞系及组织标本Stathmin的表达,观察Stathmin表达水平与食管鳞癌生物学行为的关系。通过采用RNA干扰技术及基因工程技术,构建了下调Stathmin表达的siRNA表达载体pSUPER-S2及上调Stathmin表达的真核表达载体pEGFP-stathmin和pcDNA3.1- stathmin,观察干扰Stathmin的表达对食管鳞癌细胞系生物学行为的影响。通过构建裸鼠食管癌移植瘤模型,探讨干扰Stathmin表达后对PTX化疗的增效作用。为干扰Stathmin表达用于食管癌的临床治疗研究提供实验基础。 3.性能指标： 本课题预期所要达到的总目标为：通过RNA干扰技术及基因工程技术来观察干扰 Stathmin的表达（包括上调和下调）对食管鳞癌生物学行为的影响。通过课题组近3年实验研究得出以下结论： ①食管鳞癌细胞系及组织标本中存在着Stathmin高表达,表达水平与食管鳞癌细胞的分化程度、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移有关。 ②构建的靶向Stathmin基因siRNA表达载体pSUPER-S2可以下调Stathmin的表达,抑制率达85%。下调Stathmin表达后食管鳞癌细胞致瘤作用减弱。下调Stathmin表达能促进PTX对食管鳞癌细胞的生长阻滞和诱导凋亡作用,增加PTX化疗敏感性,抑制移植瘤的生长。 ③构建的Stathmin基因真核表达载体pEGFP-stathmin和pcDNA3.1- stathmin可以上调Stathmin的表达。上调Stathmin表达后食管鳞癌EC9706细胞致瘤能力减弱。上调Stathmin表达不能增加PTX诱导细胞凋亡作用,不能增加PTX的化疗敏感性和抑瘤作用。 ④上调或下调Stathmin表达均能逆转食管鳞癌细胞恶性生物学行为。 4.与国外同类技术比较： Stathmin为一种高度保守的胞内蛋白,在多种恶性肿瘤细胞中高表达。但在食管鳞癌中的研究未见报道。 5.成果创造性和先进性： ①首次检测到食管鳞癌细胞系及组织标本中存在着Stathmin高表达,并探讨了表达水平与食管鳞癌细胞的分化程度、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移的关系。 ②首次构建了靶向Stathmin基因siRNA表达载体pSUPER-S2,证实可以下调Stathmin的表达,抑制率达85%。并观察了下调Stathmin表达后对食管鳞癌细胞的变化,及下调Stathmin表达后PTX与食管鳞癌细胞作用的变化。 ③成功构建了Stathmin基因真核表达载体pEGFP-stathmin和pcDNA3.1- stathmin,证实可以上调Stathmin的表达。并观察上调Stathmin表达后食管鳞癌EC9706细胞的变化。并证实上调Stathmin表达不能增加PTX诱导细胞凋亡作用,不能增加PTX的化疗敏感性和抑瘤作用。 ④首次观察到上调或下调Stathmin表达均能逆转食管鳞癌细胞恶性生物学行为。 6.作用和意义： 首次系统地探讨了食管鳞癌中Stathmin的表达及其临床意义。其高水平表达有望成为食管癌早期诊断及预测预后的新指标。构建了有效下调Stathmin表达的反义载体,探讨了下调Stathmin表达对食管鳞癌增殖及侵袭能力等生物学行为的影响。成功构建了Stathmin真核表达载体并于食管鳞癌细胞中高效表达,研究上调Stathmin的表达对食管癌细胞生物学行为的影响。探讨了其分子机制：可能打破了肿瘤细胞的稳态和快速增殖所依赖的微管动力平衡,使细胞无法正常分裂。该研究观察了体内、体外干扰Stathmin的表达对食管鳞癌PTX化疗的增效作用,为以Stathmin为靶点联合PTX治疗食管癌提供了新的思路和理论依据。 7.推广应用前景： 该研究结果为干扰Stathmin表达用于食管癌的临床治疗研究提供了实验基础,希望成为有效的基因治疗手段或抗微管药物的增效剂,以期提高食管癌治疗的疗效,在我国具有深远的社会效益。本实验属临床基础研究,其研究成果可以直接应用于指导临床实践。最终研究成果以科研论文形式发表,为临床应用提供可靠的信息资料。本研究已发表学术论文7篇,均在国家级核心期刊上发表,其中3篇被medline收录,1篇被SCI收录,表明该研究具有较高的学术价值。食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。肿瘤细胞的快速分裂、增殖及迁徙依赖于细胞微管系统动力不稳定性,微管调节蛋白表达的紊乱可以破坏有丝分裂、终止恶性细胞的生长。Stathmin是一种新发现的微管不稳定蛋白,通过调节微管系统的动力学平衡控制细胞周期,并以此改变细胞的增殖、分化及活性等生物学行为。本实验通过RNA干扰技术及基因工程技术来观察干扰 Stathmin的表达对食管鳞癌生物学行为的影响。其高水平表达有望成为食管癌早期诊断及预测预后的新指标,体内、体外干扰Stathmin的表达对食管鳞癌PTX化疗的增效作用,为开发应用以Stathmin为靶点的靶向药物提供实验和理论基础,具有广阔的应用前景。 具体临床实践中开发研究措施： 1.在多家医院开展对于初治食管癌患者,检测其胃镜活检标本和或术后新鲜组织标本中Stathmin的表达,预测肿瘤的恶性表型和患者的预后。 2.对于PTX化疗耐药患者,活检其肿瘤组织,检测Stathmin的表达,进行体外培养采用RNA干扰技术下调Stathmin的表达后,体外进行PTX化疗敏感性检测,证实患者PTX化疗耐药。预测采用下调Stathmin的表达的小分子药物治疗可增加PTX化疗疗效。 3.与生物工程公司或制药公司联合开发下调Stathmin的表达的小分子药物,扩大动物实验,了解其药代动力学和药理作用,启动临床实验和新药审批。 存在问题： 1.Stathmin是参与多个信号传导通路的关键分子,下调Stathmin的表达可以逆转肿瘤细胞的恶性表型,需要进一步明确其确切的作用机制。 2.下调Stathmin的表达的小分子药物为小分子反义RNA,其在体内容易降解,其稳定性需要进一步研究。