[00111934]牦牛异种克隆关键技术及其应用

牦牛是我国青藏高原以及周边地区特有的遗产资源,能够适应高海拔地区（3500 m及以上）的严寒、低压、低氧、强辐射等恶劣条件,并能充分利用高寒草原进行生产的优势种群,主要分布在中国境内的青海、甘肃、西藏、四川、云南等高寒草原地区,成为高寒牧区最主要的生产生活资料。由于特殊的地理位置和环境因素,致使牦牛的生长速度慢、性成熟晚、繁殖力低等生理特性,导致牦牛遗传进展缓慢、品种改良受阻、经济效益低、草地破坏过快等缺陷。同时牦牛的相关研究较少,严重影响了人类对牦牛生物学的认识。 自从’’多莉’’诞生以来,体细胞核移植已成为当今的热点技术之一。主要是指将供核细胞注入到去核的受体胞质中,构建成一个核质复合体,通过外界的辅助作用进行重编程,最终获得一个新的胚胎。该技术具有巨大的研究和商业价值,可运用于人类器官的克隆与移植、转基因动物的研究、疾病模型生物建立、濒危物种的保护等流域。然而至今该技术的效率依旧很低,显著制约了该技术的推广与运用。目前,通过此技术已获得克隆后代的物种有猪、牛、羊等,如中国专利CN98110828.8,CN00816831.8, CN00800632.6,CN00818200.0。随着技术的发展与衍生,异种核移植为濒危物种以及难于获得卵母细胞物种提供了有利的技术手段。 由于常规的电激活-化学激活方式对牦牛-牛异种克隆胚胎的卵裂和囊胚形成率不够理想,胚胎的体外发育率以及囊胚的质量有待进一步的完善和提高。同时,由于商品化的胚胎体外培养体系中普遍添加了血清或血清白蛋白。然而大量研究表明,血清或血清白蛋白对早期胚胎的发育是有害的,有可能改变胚胎的代谢、超微结构、印记基因的甲基化状态及胎儿的肥大综合症。无论是血清还是或血清白蛋白,化学组成成分都相对复杂,存在许多未知的因子,不利于胚胎体外发育动力学的研究。此外,血清或血清白蛋白均为病毒的携带者。因此建立一个组成成分更明确、更安全、更有利于胚胎的体外及后期发育的培养体系也是非常必要的。 为此,本发明建立构建异种克隆牦牛胚胎及体外培养的方法,降低胚胎的发育阻滞、提高胚胎的体外发育率以及囊胚的质量,为今后开展牦牛细胞生物学以及发育生物学提供有利的技术保障,为建立牦牛优良的遗传资源保存奠定基础。 一种获得异种克隆牦牛优良胚胎的方法,从新鲜的牛卵巢中采集卵母细胞为受体细胞,采集成年母牦牛的乳腺组织,培养的乳腺上皮细胞作为供核细胞,将供核细胞直接注射到去核的卵母细胞卵周隙中,形成重构胚,所述重构胚经激活和体外培养后获得异种克隆牦牛胚胎。