[00112228]生物素标记法钓取淫羊藿素受体及其下游促进骨形成信号转导途径的研究

本课题成果源自于联勤保障部队第九四〇医院骨科研究所陈克明课题组承担的国家自然科学基金项目：生物素标记法钓取淫羊藿素受体及其下游促进骨形成信号转导途径的研究,批准号：81471090。淫羊藿苷是中草药淫羊藿的主要有效成分之一,已知其能够促进骨形成和抑制骨吸收,具有开发为抗骨质疏松新药的潜在价值。但淫羊藿苷抗骨质疏松的作用机制至今不明,其受体为何尚不清楚。本项目提出利用淫羊藿素的羟基与生物素的羧基发生成酯反应,合成生物素化淫羊藿素（Bio-I）,然后基于生物素与链霉亲和素的高亲和力而发展出针对Bio-I的免疫荧光染色和免疫共沉淀技术,用以显示淫羊藿苷进入成骨细胞后的轨迹及钓取淫羊藿苷的受体蛋白等,并进而找到至少一条新的淫羊藿苷促进骨形成的信号转导途径。本项目已按计划完成大部分研究任务,取得如下重要成果：1.成功合成3,7-二生物素淫羊藿素（Bio-I）,并确认其促进骨形成活性无显著下降;2.成功建立基于Bio-I的免疫荧光染色技术,并用此技术观察了Bio-I进入成骨细胞后的运动轨迹。发现其大部分时间分布于细胞核周围,但始终未进入细胞核内部;3.用挂了Bio-I的免疫磁珠钓取到与Bio-I结合的蛋白质,并进行质谱分析及western blot鉴定;4.用GE公司开发的Biacore技术钓取与Bio-I结合的蛋白质,经质谱分析发现,至少含有146种蛋白质,确定一种分子量为47KD的未知蛋白具有潜在研究价值;5.发现CXCR4也位于钓取蛋白之列,其表达量呈现明显的先增加后逐渐衰减的变化趋势,如用特异性阻断剂AMD3100预处理成骨细胞,则淫羊藿苷促进骨形成活性完全消失,从而首次发现淫羊藿苷通过SDF-1/CXCR4信号途径促进骨形成。6.未观察到Bio-I进入初级纤毛,Bio-I与初级纤毛在空间分布上无明显交集。如用RNA干扰法抑制初级纤毛发生,则淫羊藿苷促进骨形成活性消失,说明初级纤毛为淫羊藿苷促进骨形成所必需;7.发现淫羊藿苷通过初级纤毛调控的sAC/cAMP/PKA/CREB信号途径促进骨形成,其中sAC和p-PKA均被定位于初级纤毛内;8.淫羊藿苷或淫羊藿总黄酮可提高生长期大鼠的峰值骨量,其作用机制是通过sAC/cAMP/PKA/ CREB信号途径促进骨形成,而对骨吸收则无明显影响。本项目初步阐明了淫羊藿苷促进骨形成的信号转导机制,对今后以淫羊藿苷为先导化合物的抗骨质疏松新药研发具有重要指导意义。本项目培养博士生1名,硕士生5名,发表期刊论文39篇,会议论文16篇,其中北大核心期刊论文26篇,SCI论文6篇。项目获得甘肃省科学进步一等奖1项。