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本发明公开了一种扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法及其应用。本发明利用ISAP分子标记技术来构建不同扁穗牛鞭草种质的DNA指纹图谱,有利于对无性系扁穗牛鞭草进行快速、准确的鉴定,与常规的形态检验与生化检验相比,不受生长环境和季节的影响,结果更可靠,省时省力;本发明具有操作简单、直观实用等特点,可以促进ISAP分子标记技术在准确、快速、简便的品种鉴定中更广泛地应用,同时应用该方法,对扁穗牛鞭草无性系种质的遗传变异进行鉴定,从而实现对扁穗牛鞭草无性系种质变异的早期筛选及新品种选育的需要。