[00113517]一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法

1、课题来源与背景自上世纪九十年代以来,DNA分子标记技术的开发及应用进展十分迅速,新的DNA分子标记技术不断出现,基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术也在同步涌现。一般来说,后面出现的DNA分子标记技术大都吸收了前面的优点且克服了它们的部分不足,使之不断优化,但现有的DNA分子标记技术缺陷仍然十分明显,存在着引物退火温度低、引物设计复杂、引物数量少、操作重复性差和趋向于扩增非功能编码区域等缺点。因此,开发一种引物设计简便、引物合成费用低、利用率高、引物退火温度高,操作简单、高效、重复性好、特异性高、多态性高的新型DNA分子标记技术十分必要。为此,广西农业科学院经济作物研究所的花生研究团队设计研发出了本发明专利,并于2017年12月22日获得中华人民共和国国家知识产权局的授权。 2、技术原理及性能指标（1）技术原理现有的DNA分子标记技术缺陷仍然十分明显,需要开发一种引物设计简便、引物合成费用低、利用率高、引物退火温度高,操作简单、高效、重复性好、特异性高、多态性高的针对基因外显子区域扩增的基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术。（2）性能指标 一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法,包括以下步骤：根据真核生物基因组中基因外显子区域富含GC设计并合成单引物,提取样品基因组DNA作为模板,利用设计好的单引物和所提取的样品DNA模板在常规PCR反应体系和PCR反应程序下进行PCR扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离,凝胶电泳分离后检测单引物在基因组基因外显子区域中的两个结合位点间的多态性。所述的单引物是指一个PCR反应中只使用一条固定引物,这一条固定引物同时充当正向引物和反向引物的角色,该固定引物是基于真核生物基因组中基因区富含GC来设计的,引物序列长度17bp,5’端的6个碱基填充序列为富含AT碱基的限制性内切酶酶切位点序列,中间核心区序列是由8个GC碱基随机排列组成,这14个碱基组成核心序列,最后3’端是3个选择性随机碱基。进一步地,所述单引物的序列可以为下述Mme1-Mme15中的任意一种,引物序列走向为5’端到3’端：Mme1：GAATTCCGGCGGCGATA;Mme2：GAATTCCGGCGGCGATC;Mme3：GAATTCCGGCGGCGATG;Mme4：GAATTCCGGCGGCGAAC;Mme5：GAATTCCGGCGGCGTGC;Mme6：GAATTCCGGCGGCGTAC;Mme7：GAATTCCGGCGGCGTCG;Mme8：GAATTCCGGCGGCGTGA;Mme9：GAATTCCGCCGCCGATA;Mme10：GAATTCGGCGGCGGATC;Mme11：ATCGATCGGCGGCGATC; Mme13：ATATATCGGCGGCGATC;Mme14：ATATATCGGCGGCGATG;Mme15：ATATATCGGCGGCGTCG。图1 一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术示意图图2 引物Mme4（A）和Mme9（B）在16份花生材料中的扩增结果 3、技术的创造性与先进性本发明专利除具有操作简单、稳定性高、重复性好、数量丰富、特异性高、多态性高、结果可靠等优点外,因提供的单引物设计是根据真核生物基因组中的基因外显子区域富含GC碱基的原理来设计的,引物可以在真核生物间通用,大大减少了引物的合成费用,也大大提高了引物的使用利用率,同时产生的多态性标记与基因外显子序列紧密连锁,为功能型标记,可用于研究真核生物的遗传多态性、亲缘关系、种质鉴定、遗传连锁图谱构建、基因定位和分子标记辅助选择育种等,适合广大科研单位的研究人员使用。 4、技术的成熟程度,适用范围和安全性本发明专利是在广西农业科学院经济作物研究所的花生研究团队长期从事经济作物研究和发明人反复实践的基础上,针对当前现有的DNA分子标记技术存在着的缺点,设计研发而出,适合于研究各种动植物分子标记的广大人员使用,技术成熟可靠,应用范围广,安全性高,不会对环境造成破坏。 5、应用情况及存在的问题本发明专利目前正处于小批量或小范围应用阶段,后期在保证有足够人力、物力和资金投入的条件下,试图寻找合适的公司企业,通过与公司企业合作对该成果进行转化和规模化应用。