[00116605]基于NASBA的基因芯片快速检测细菌耐药性方法的建立

由于抗菌药物选择性压力、耐药基因突变及耐药传播等原因,多重耐药菌（multi-drug resistance organism,MDRO）感染已成为当前世界范围内的威胁,是导致医疗费用增长和死亡率增加的主要因素。目前临床多采用细菌培养进行细菌鉴定,但该方法检测周期长,并且有些细菌的培养要求较高,容易出现假阴性的结果。在前期使用抗生素情况下更容易出现假阴性。现在国内外将分子生物学技术应用于多重耐药菌检测方面取得了一定进展,但是低通量、技术要求高、检测时间长的缺陷阻碍了它们的推广应用。如PCR技术对模板DNA的质量、仪器设备及检测场所要求较高。依赖核酸序列扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA）是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术,具有更高的灵敏度和准确性,而且操作方便,不需要特殊的控温装置。因此本研究为建立一套以NASBA方法为基础的快速简便的耐药基因检测方法。 1、建立了以RNA为模板的快速扩增NASBA实验方法。本研究以肺炎克雷伯菌的管家基因MDH为例,通过对NASBA反应中各酶浓度、离子浓度、DTT浓度、反应温度等条件进行摸索和改进,扩增产物进行逆转录后进行DNA测序鉴定,建立了一套完备的NASBA反应体系。最终确立的反应体系为建立NASBA扩增体系（24μl）：缓冲液中氯化钾终浓度60mmol/L,氯化镁终浓度14mmol/L,PH8.0 Tris-HCl 终浓度40mmol/L,DTT终浓度 7.5mmol/L,DMSO终浓度15%;每个引物终浓度0.2μmol/L;dNTP 1mmol/L;NTP 2mmol/L;酶混合液中T7 RNA聚合酶50U、AMV逆转录酶10U、Rnase H 0.5U、BSA 0.1mg/ml;反应温度：40℃;反应时间：90min。扩增产物测序结果与参考序列一致。 2、完成NASBA方法在临床标本耐药性检测的验证。将本研究组建立的NASBA检测手段进行临床治病菌株的耐药基因检测验证,45株临床收集的肺炎克雷伯菌中32株NASBA扩增阳性,13株NASBA扩增阴性,与药敏、PCR、RT-PCR结果一致,符合率达到100%。因此本实验采用依赖KPC转录产物mRNA的NASBA扩增检测KPC耐药。