[00117609]一对转录激活子样效应因子核酸酶L1和R2及其编码基因与应用

1.按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入我们需要的序列,一方面可以构建出各种动物模型用于生物学基础研究和疾病机理研究,另一方面可以生产动物反应器用以廉价生产我们需要的又很难从其他途径得到的生物组分。 人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换,其打靶效率非常低,通常只有〖10〗^（-6）-〖10〗^（-8）,这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用,而在其他模式动物及大型哺乳动物中都因效率太低而得不到广泛应用。 近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般由序列特异的核酸酶由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成。原理是首先由DNA识别域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域,然后非特异性核酸内切酶切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strand break,DSB）,引入的DSB激活的DNA自我修复可以引起基因的突变和促进该位点DNA同源重组。锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases,ZFN）是现在研究最清楚也是应用最广的序列特异的核酸酶。其原理是两个锌指蛋白特异识别两段相隔5-7bp的DNA序列,并把与之融合表达的非特异性DNA切割蛋白Fok1的两个单聚体定位到了一起,DNA切割蛋白形成双聚体时可以切断该位置的双链DNA,从而造成DSB。ZFN的出现使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步,然而,ZFN技术还存在靶向不确定性、效率低、拖把率高等问题,研究者很难自行设计出特异和高效的靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是制约ZFN广泛应用的瓶颈。而商业购买高效特异的锌指核酸酶又价格昂贵（20万人民币/基因）,一般研究者或商业公司根本无法承受这笔费用。 2.本发明公开了一对转录激活子样效应因子核酸酶L1和R2及其编码基因与应用。这对转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）由一对DNA识别蛋白分别与Fok1DNA内切酶的两个异源亚基融合得到,可以特异性地识别人RPE65基因exon1上的两个相邻位点。将这对转录激活子样效应因子核酸酶同时转入宿主细胞时,其能对宿主细胞RPE65基因的exon1位点打靶,并使打靶位点发生基因突变,从而实现对人RPE65基因的靶向修饰,具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点。