[00117831]溺死相关浮游生物DNA检测技术建立及应用

水中尸体的死因诊断依旧仍是一个难题。困难源于检验鉴定方法种类较少,稳定性不足,取材难度高和难以标准化等。在我国溺死已经成为第3位意外致死的死因;也成为0～14岁未成年人的非正常死亡的第1位死因,达到56.6%,尤以农村更为明显。水中尸体绝大多数死亡原因为意外溺水,一小部分为自杀或是他杀,极小部分是伪造意外死亡的抛尸入水毁灭证据的犯罪案件。人命关天,经常诱发剧烈的社会影响,如“贵州瓮安事件”、“监利游船倾覆造成多人死亡的特大事件”等。因此,案事件的定性对于解决案事件和稳定社会影响具有积极的社会意义。案事件的定性关键在于诊断溺死与否及落水点。本研究成果利用分子生物学方法,检测溺死尸体中内在封闭器官的藻类相关靶基因,建立系统的复合扩增检测体系,并取得初步应用成果。通过筛选靶基因及确定种类来源：从Genbank中下载藻类与浮游细菌共11个靶基因,分别是18S rDNA基因、UPA基因、rbcL基因、ITS基因、mcyA基因、SSU基因、16S rDNA基因、hlyA基因、aerA基因、gyrB基因、16S rDNA基因的序列,并比照文献,运用ClustalX 2.0软件分析,选择序列高变区;针对高变区的两侧保守区,用Primer premier 5.0设计了49对引物。采用大型动物进行实验研究,以靶基因为基础建立分子生物学方法的可靠性;采用UPA基因、rbcL基因、18SrDNA基因、建立的PAGE方法、CE方法、RT-PCR方法等方法对溺死实验中动物样本进行检测。UPA基因、rbcL基因等建立的CE方法能检测溺死相关硅藻（念珠藻、针杆藻、舟形藻、直链藻、小环藻、菱形藻、脆杆藻）,能兼容于目前法医物证实验室的工作平台,便于推广,且与电镜检测方法无统计学差异;18SrDNA基因等建立的CE方法与电镜检测方法有统计学差异;以UPA基因建立的RT-PCR方法的灵敏度要比UPA基因建立的CE方法高100倍左右。建立的复合扩增体系使用五色荧光标记14个浮游生物相关基因座,而对通过扩增检测人、3种人体共生菌及4种其它浮游生物,结果均为阴性。该复合扩增检测体系能对应扩增检测特征超过20种溺死相关浮游藻类（普通小球藻、桥弯藻、蛋白核小球藻、舟形藻、产毒铜绿微囊藻、脆杆藻、菱形藻、镰形纤维藻、海洋原甲藻、锥状斯克里普藻、链状亚历山大藻、斜生栅藻、蛋白核小球藻、柔细束丝藻、镰形纤维藻、直链藻、鱼腥藻、念珠藻、不产毒铜绿微囊藻、针杆藻）的11个靶基因（rbcL、COX1、16SrDNA、rbcL、mcyD、18SrDNA、CENA33、16SrDNA、23SrDNA、COXⅠ、psbA）;并且能扩增检测2种溺死相关水生浮游细菌（维氏气单胞菌、杀鲑气单胞菌）的3个靶基因（aer 、proD、 hly）,进一步提升该复合检测体系对溺死诊断的准确性。实际溺死案例一次性检测肺脏、肝脏、肾脏的的总检出率分别可达：94.59%、81.08%、75.68%;实际案件采用复合扩增与MD-VF-Auto SEM法检测结果总阳性率不具有统计学差异（p ＞ 0.05）。 形成《溺死相关浮游生物的DNA检验技术及应用》的研究报告1份,已发表专著《溺死法医诊断学》1本,获公安部标准立项《硅藻 rbcL基因特异片段检测--毛细管电泳荧光检测法》1项;进行科研实验,在国内外发表刊物11篇,其中SCI收录6篇,申请发明专利4项;在溺死检测技术上,扩大学术影响力,参加国际学术会议交流5人次,在大会发言2次;研究过程中,带动科技人才培养,已培养研究博士研究生2名,硕士研究生4名;建立的多种分子生物学方法的检测了超过200具以上的水中尸体,对多个单位送检的水中尸体样本进行分子生物学与电镜检验的结果比对,效果显著。