[00119066]蝉花麦角甾醇过氧化物在肾间质成纤维细胞转分化中的作用及其分子机制的研究

一、课题来源与背景： 本研究项目来自上海市教委课题基金。 慢性肾脏病,具有患病率高、医疗费用巨大、易合并心血管疾病和病死率、致死致残率高等特点,给家庭和社会带来沉重的经济负担。 肾间质纤维化,指由多原因引起的细胞外基质成分在肾间质内过度沉积和肾间质成纤维细胞的增生,是各种慢性肾脏疾病发展到终末期肾衰竭的共同通路。肾功能恶化的发展程度也取决于肾间质纤维化的进展和严重程度。研究表明,肌成纤维细胞是细胞外基质的主要来源,其增多与聚集是肾间质纤维化的组织形态学特征。肾脏固有的间质成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化是肾间质纤维化进程中不可或缺的组成部分。 冬虫夏草是一种广泛应用于慢性肾脏病治疗的中药。有关虫草抗肾间质纤维化、缓解肾功能进行性恶化的作用已多有报道。蝉花属虫生性药用真菌,寄生于鸣工蝉蛹体上,是蝉在羽化前,感染蝉拟青霉等真菌寄生的产物。蝉花其性味甘寒而与虫草有别,是一种具有药用、滋补功效的珍贵药材。对蝉花与冬虫夏草的现代药理学研究发现,两者具有相似的活性成分。 天然蝉花及其人工培养物的提取物具有多方面的药理作用：①解热、镇痛、镇静催眠等作用。②滋补强壮作用。③降低血压、减慢心率作用。④抗疲劳抗应激作用。⑤降低血糖作用。⑥改善脂质代谢、抗动脉硬化作用。⑦抗肿瘤作用。⑧免疫调节作用。 本研究组对于蝉花治疗慢性肾功能衰竭的前期临床及实验研究显示,蝉花及其人工培养物具有降低血肌酐、尿素氮水平,提高内生肌酐清除率,改善血浆白蛋白、血红蛋白及甘油三酯水平,减少尿蛋白等功能,对缓解早、中期慢性肾功能不全患者的疗效确切,能延缓实验动物肾小球硬化进程和慢性肾衰竭进展速度。 二、研究目的与意义 本研究项目通过人工培养蝉花菌丝,提取其麦角甾醇过氧化物（EP）,利用细胞培养、分子生物学技术研究EP对肾间质成纤维细胞转分化的影响;检测JNK/p-JNK、p38/p-p38蛋白表达水平变化,研究EP在肾间质转分化中的作用机制,为蝉花的临床应用进一步奠定理论基础。 三、创见与创新 蝉花是一种传统中药,其与广泛运用于肾脏病治疗的冬虫夏草均为虫生药用真菌。在前期研究中,我们创新性地应用蝉花进行慢性肾衰竭的临床及实验研究,取得了较好的疗效。为了给蝉花临床治疗提供更广泛的理论依据,本课题首次在分子细胞水平和整体动物模型中探讨了由蝉花提取物麦角甾醇过氧化物对肾间质纤维化的缓解作用,具有很强的原始创新性; 本研究首次探讨蝉花EP与TGF-Β、JNK、P38信号转导通路的关系,探索中药治疗的分子机制有益于阐明药物机制、提高疗效降低副作用,更进一步为老药新用的开发奠定基础。 四、社会经济效益 蝉花的人工培养并研制抗肾脏纤维化的中成药,具有显著的经济效益。 对于慢性肾脏病,现代医学在药物治疗方面尚无重大突破。蝉花及其制剂的临床广泛应用,能有效减轻众多慢性肾脏病患者痛苦、提高生活质量,延缓慢性肾功能衰竭的进程,减少透析及肾移植患者数量,减轻个人、家庭、国家和社会经济负担,具有巨大的经济和社会的双重效益。 五、获奖情况 天然蝉花及蝉花菌丝治疗慢性肾病的临床及实验研究,获“上海医学科技奖”三等奖。 六、成果简介 1.成功从人工蝉花中提取麦角甾醇过氧化物（EP）,建立成熟的EP的提取技术及鉴定技术; 2.运用不同剂量及不同时间的EP对大鼠肾间质成纤维细胞NRK49F的刺激作用,通过MTT检测细胞活性改变,确定蝉花EP的安全剂量及时间; 3.通过运用转分化刺激因子TGF-β的诱导转分化作用,在NRK49F中建立肾间质成纤维细胞转分化模型,利用相关蛋白及细胞生物学特性的检测研究EP对肾间质成纤维细胞转分化的影响; 4.证实EP可以有效的抑制由TGF-β诱导的肾间质成纤维细胞的增殖,这一作用表现为剂量依赖和时间依赖; 5.证实EP可以有效地抑制由TGF-β诱导的肾间质成纤维细胞的转分化相关蛋白（α-SMA 和vimentin）的表达增殖; 6.ECM是肾间质纤维化中的重要环节。通过免疫组化实验我们证实：EP可以有效地抑制由TGF-β诱导的细胞外基质（ECM）的表达,从而可能延缓肾间质纤维化的进展; 7.探讨了EP作用下NRK49F细胞系CTGF、ERK1/2/p-ERK1/2、JNK/p-JNK、p38/p-p38蛋白表达水平变化,从信号通路角度进一步研究EP在肾间质成纤维细胞转分化中的作用机制。