[00120175]宁夏牛病毒性腹泻病毒新亚型基因及变异性研究

成果意义：旨在解决宁夏地区BVDV的流行亚型多样性和新亚型毒株的致病特征方面的问题。首先用BVDV 抗体检测试剂盒（ IDEXX BVDV Total Ab）、抗原检测试剂盒（ HerdCheck BVDV antigen/Serum Plus）和分子生物学方法对宁夏地区牛场发病牛血液样品进行系统检测,分离病毒并测定病毒N基因和E2 基因,进行序列分析,建立流行毒株的系统发育树,阐明宁夏BVDV病毒的基因分型多态性和抗原变异;进而利用获得的新亚型毒株BVDV-1毒株人工感染健康成年牛,观察其临床症状并评分,以荧光定量RT-PCR、病毒抗原测定阐明新亚型毒株感染动态变化,结合检测白细胞、淋巴细胞数量测定,揭示新亚型毒株的致病特征。本研究可揭示宁夏地区BVDV流行的新常态和新亚型毒株的致病机制,为该区BVD的防控提供技术支撑。 成果技术简介：1.于宁夏回族自治区内平罗、大武口、贺兰、银川、灵武、青铜峡、吴忠7个市县的13个规模化奶牛场内的新生犊牛或者育成牛（1岁内）,进行尾静脉采血,经离心后提取血清,其中1890份血清用于BVDV 抗体ELISA检测,接着从抗体强阳性的样品中挑选820份血清用于BVDV 抗原ELISA检测,试验后得出其中BVDV抗体阳性样本数总计为1750份,结果不同地区不同牛场的阳性率差异不大,阳性率为88.24%～100%,平均阳性率为95.27%。针对抗原阳性间隔14天抗原仍然是阳性的牛血清样本49份确定为持续感染（PI）牛。 2、完成分离 BVDV 流行毒株,通过测定 N 基因和 E2 基因,建立毒株的系统发育树,揭示宁夏 BVDV 病毒的基因分型多态性和抗原变异。 利用系统发生树鉴定宁夏的BVDV主要亚型包括BVDV-1a（YC2、QTX1）、BVDV-1d（QTX5）、BVDV-1m（YC3、QTX4、QTX6、QTX7、QTX9）、BVDV-1q（QTX8）以及BVDV-2型,所获亚型与我国流行的BVDV亚型一致。 3、选择抗原阳性的样品,接种牛肾细胞 MDBK,盲传3代后利用间接免疫荧光检测病毒分离结果,对病毒的生物型进行分析。 病毒分离和免疫荧光鉴定：成功分离获得NCP型BVDV毒株,命名为NX2019/01。病毒基因组扩增、克隆及序列测定：利用9对引物进行RT-PCR分段扩增NX2019/01毒株基因组,经琼脂糖凝胶电泳,获得与预期大小相符的9个目的片段。回收目的DNA片段物,克隆pGEM T-easy载体、利用菌落PCR获得阳性克隆,测序拼接后获得命名为NX2019/01毒株的基因组序列,全长为12001nt。 4、NX2019/01毒株多态性分析 为了解其完整的基因序列特征,对NX2019/01 F6代毒株进行了基因组测序。NX2019/01毒株基因组NX2019/01毒株基因组长12101bp（5′UTR和3′UTR部分测定）,其ORF长11703 nt,编码3 898个氨基酸。在全基因组水平,NX2019/01株与我国SD-15、ZM-95、XC、LN-1等1m亚型分离株（92.17%～93.84%）相似性较高,但抗原基因Erns和E2存在较大差异。毒株在持续感染过程中未发现E2基因编码抗原区氨基酸的变异,但与同基地急性感染牛高度同源的病毒抗原区存在1个氨基酸的差异。重组分析表明,NX2019/01株E2基因179位～288位以及ZM-95株E1基因168位～E2基因332位存在类似的重组信号,均为SD-15株与LN-1株重组导致,表明NX2019/01株、ZM-95株在进化上与SD-15株以及LN-1株存在密切关联。 5、利用分离获得的NX2019/01持续感染毒株4mL鼻内接种3头成年健康公牛,分析其致病机理。 6、成功制备了BVDV重组C蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV衣壳蛋白诸多功能的研究奠定了基础。 7、发表文章3篇,颁布地方标准1项,申请地方标准2项,申请发明专利1项,申请实用新型专利1项。