[00120344]HIV与宿主细胞相互作用对抗HIV药物影响的研究

在本课题的工作中,主要研究了人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的重要调节蛋白基因TAT对其主要的天然宿主细胞人的T细胞中的ABC转运蛋白基因表达和功能的影响,并探讨其作用机制。 首先,得到了转染了TAT基因并能持续稳定表达Tat蛋白的人T细胞白血病细胞系Jurkat的表达株Jurkat-tat。获得了Tat蛋白的原核表达系统,并得到了Tat蛋白。 其次,利用上述的Tat蛋白的表达细胞株和Tat蛋白作用于Jurkat细胞,分析Tat蛋白对Jurkat细胞中ABC转运蛋白基因表达的变化。研究发现：就目前已经确定和药物外排有关的十九种ABC转运蛋白而言,大多数基因的表达在Tat蛋白的作用下都发生了不同程度的改变。ABCA2、B1、B11、B5、C1、C2、C4、C10、C11、G2发生了上调,A3、B4、C3、C5、C6发生了下调。其中ABCG2和ABCC5的改变最为显著,Jurkat-tat中ABCG2的表达量是Jurkat中的6.57倍,而ABCC5的表达量在Jurkat-tat中是Jurkat的28%。同时,在三种不同类别的抗HIV药物作用下,上述转运蛋白基因也发生了不同的改变,其中AZT诱导了ABCA2、A3、B1、C1、G2等十一个基因下调,沙奎那韦诱导除ABCB4、C6之外的十三个基因上调,而奈韦拉平则是诱导ABCA2、B1等七个基因上调,ABCB4、C1、C2、G2等八个基因下调。然而将药物应用于Jurkat-tat细胞上,结果发现在Tat和药物共同作用下大多数基因都发生了上调。有此可见Tat蛋白以及抗HIV药物对ABC转运蛋白基因家族的影响是复杂且多样的。 在此基础上,重点研究表达状态变化最大和最为常见的ABCG2、ABCC1-5和ABCB1的功能变化。流式细胞仪测量上述蛋白对荧光底物的外排能力。结果发现Jurkat-tat的ABCG2的外排功能明显增强,并且这一外排功能的增强能够被ABCG2的特异性抑制剂Ko143所抑制。证明Tat蛋白可以显著刺激ABCG2基因的表达并增强其外排功能。ABCB1功能变化幅度不大。而ABCC1-5则由于既有发生上调的,也有发生下调的,因为目前没有能够特异性的区别这几种蛋白转运和功能的荧光底物,所以无法分别研究它们的功能变化,总体而言ABCC1-5的功能轻度增强。 为了能够深入了解以上调控的机制,使用生物芯片等技术检测相关调控基因的变化,并利用构建克隆有上述基因启动子的报告质粒,转染细胞检测不同片段的表达活性的差异,以及药理学方法分析发现,NF-kappaB在ABCG2表达上调中可能起重要作用。 本课题研究的部分结果以论文形式发表,1篇发表在SCI收录1区期刊,1篇2区,1篇4区。还有1篇文章已经投稿,2篇文章正在准备当中。目前后续研究工作有1项国家自然基金资助进行。