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本发明提供一种制备硫酸依替米星的方法,包括以下步骤: 1)将浓度为50~100mg/ml的含有依替米星的粗溶液的pH调节至9.0~12.0,得到母液; 2)上述母液上大孔吸附树脂柱,用水洗脱,然后用pH2.5~3.0的稀硫酸溶液洗脱,再用pH1.5~2.0的稀硫酸溶液分步洗脱收集,最后浓缩为含50~100mg/ml硫酸依替米星的溶液,得到初分离溶液; 3)将上述初分离溶液的pH调节至10.0~11.5,然后上反相吸附树脂柱,用水洗脱,然后用pH1.5~2.0的稀硫酸溶液分步洗脱收集,最后浓缩为含100~200mg/ml硫酸依替米星的溶液,浓缩后冻干即得精制品。