[00121651]烟草cDNA文库构建及重要基因表达谱研究

“烟草cDNA文库构建及重要基因表达谱研究”是国家烟草专卖局2007年重点科研项目,该项目主要技术包括构建不同烟草材料不同发育时期及胁迫条件下的cDNA文库,开展文库测序及转录组测序,分离和克隆烟草重要性状基因,研究其表达情况,并通过RNAi技术验证基因功能。 （一）项目实现的主要技术和性能指标 1.构建了红花大金元、净叶黄、小黄金1025、大白筋599,K325、白肋21,巴斯玛、N. tomentosiformis,N.sylvestris,N.repanda和N.afiricana等烟草材料幼苗期、旺长期、成熟期的叶片、腋芽、根等材料和组织的全长cDNA文库、均一化文库及对病毒性抗性差减杂交文库等共32个。 2.对红花大金元叶片全长cDNA文库、K326叶片腺毛全长cDNA文库及林烟草和绒毛状烟草均一化cDNA文库进行测序,获得31325条EST和4374个全长基因。 3.采用SoleXa测序技术,对6个烟草材料的16个组织进行转录组测序,获得各约5万个unigene及全长基因18450个。对数据进行了新的转录木鉴定、基因结构分析、选择性拼接分析和初步的差异表达分析。并在此基础上,基于Linux+Apache+MySQL+PHP构建了烟草基因表达谱数据库,实现了一网络服务和blast等功能,满足数据查询和序列比对的需求。 4.以绒毛状烟草基因组为参考序列,通过转录组测序数据分析,鉴定了15个可能参与烟碱合成的关键酶候选基因,262个CYP450代谢酶家族基因,1280个可能参与烟草香气、色素等次生代谢途径的候选基因及1924个转录因子,513个NBS-LRR类抗病基因。此外,在林烟草、耳状烟草和普通烟草转录组数据中分别鉴定出220,247,320个含有NBS-LRR结构域的序列。 5.利用RT PCR和RACE技术在烟草中克隆了NtLS,NtCDPK. Ntasp,NtFLC、NtPSCS. Nt s -OAT,NtC01,NtLox3等8个基因（家族）,并对其在花芽、根、腋芽和茎尖等组织中的表达进行了分析。构建了NtLS和NtLox3启动子及抗病分析的RNAi载体,获得了转基因烟草植株,并对其功能进行了初步阐述。 （二）成果的创造性、先进性 1.对多种烟草材料的不同发育时期和不同组织进行全长cDNA文库的构建并对其中4个文库进行规模化测序和生物信息学分析。 2.首次对林烟草、绒毛状烟草和栽培烟草的多个组织开展规模化的转录组测序和生物信息学分析。 3.构建了国内首个同时基于EST和转录组测序数据的烟草表达谱数据库。 4.开展了8个烟草重要基因（家族）的克隆和表达分析。 5.首次开展lVtLS基因RNAi干涉及采用GatewayTM技术构建病毒病、真菌性病害抗性基因的RNA干扰表达载体（库）的构建与转化。 （三）成果的作用意义 本项目研究结果对于为下一步烟草全基因组转录本的注释和功能基因研究奠定了良好的基础,对于烟草基因组计划重大专项的启动和实施,具有重要作用和意义。