[00122631]高活菌数复合益生菌发酵乳制品的研发及其质量评价

1、任务来源：本课题是齐齐哈尔市科技局立项课题,项目编号：SFGG-201557。 2、应用领域和技术原理： 双歧杆菌是一种典型的益生菌,本课题以双歧杆菌为研究对象,以研发益生菌发酵乳制品为目的,探索多菌种发酵之间的关系,通过优化生产工艺提高益生菌的活菌数并采用real-time PCR方法检测其在发酵乳制品中数量变化,为制作高质量且益生菌活菌数高的产品提供理论依据。 3、性能指标： 益生菌干酪中益生菌的活菌数是非常重要的指标,需达到106cfu/g才能发挥益生作用。传统的定量检测方法依靠特定的微生物培养基对食品中活菌进行分离和计数,整个检测过程复杂、费时、专一性不强。实时荧光定量PCR技术检测时间短、定量准确。本文采用荧光定量PCR法检测农家干酪中双歧杆菌的活菌数,在干酪贮存的1、5、10、15、20天时分别检测益生菌数量。在干酪的贮存期内,双歧杆菌的活菌数均大于108cfu/mL,且滋气味良好。 4、与国内外同类技术比较： 在国外,使用荧光定量PCR方法计数干酪中益生菌活菌数已经得到充分研究并延伸至各种食品中。Emilie使用荧光定量PCR方法计数切达干酪在制作和成熟过程中双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌活菌数的变化。并使用叠氮溴化丙锭（PMA）对样品基因组提取进行前处理,使PMA与样品中死细胞的DNA分子共价交联,并抑制该DNA分子的PCR扩增.这种方法解决了PCR不能区分死菌活菌的弊端,使定量更加准确。结果表明,PMA可以抑制死菌的DNA扩增,所有益生菌在干酪的成熟过程中都保持较高活性（109 cfu/g）。Sonia使用两种不同的方法从发酵香肠中提取DNA。这是由于发酵香肠成分复杂并且含有PCR抑制因素和背景菌群。结果表明,两种方法提出的DNA纯度较好且在复杂肉类发酵食品中,荧光定量PCR是一种有效的计数工具。在我国,荧光定量PCR也得到一定发展。赵红波使用荧光定量PCR结合EMA/PMA染色法检测水中致病菌军团菌的活菌数。李聪聪应用荧光定量PCR的方法检测食源性致病菌大肠杆菌的活菌数。包秋华用荧光定量PCR的方法检发酵乳中嗜酸乳杆菌的活菌数。综上,可以看出荧光定量的方法多应用在致病菌的检测,在乳制品中也多用于发酵乳中益生菌的检测。到目前为止,仅一篇文献提到用PCR-DGGE的方法检测切达干酪中干酪乳杆菌活菌数,而应用荧光定量PCR方法检测干酪中益生菌活菌数的研究尚无。 5、成果的创造性、先进性： 国家标准：益生菌发酵乳制品中的益生菌活菌数＞106cfu/g。本研究制作的干酪在货架期内,活菌数 ＞108cfu/mL,大于国家标准,接近国外平均水平且风味良好。并建立了一种快速、准确测定益生菌干酪中益生菌活菌数的检测方法。 6、作用意义： 随着人们生活水平的提高和对健康食品的不断追求,乳及其制品在日常饮食中占有的比例逐年增大。干酪是一种 “浓缩”的乳制品,营养成分丰富。益生菌干酪,是新型干酪的一个研究热点,也是益生菌食品最为青睐的一类食品。研发一种符合我国消费者口味的益生菌干酪势必引领继酸奶之后的又一热销产品的潮流。在我国,除西藏的曲拉等传统干酪产品外,国内的干酪生产刚刚起步,生产重心主要停留在再制干酪加工和进口产品分装上。开发可被中国消费者接受风味淡香的干酪依旧是各大乳制品企业着力研究的重点。本研究致力于制造一种风味温和、口感适宜易的干酪产品,使其既符合我国消费者口味又具有益生功效。 7、推广应用的范围、条件和前景以及存在的问题和改进意见： 益生菌干酪,是新型干酪的一个研究热点,也是益生菌食品最为青睐的一类食品。从1994年Dinakar等第一次以双歧杆菌研究益生菌切达干酪以来,越来越多的研究者把益生菌和干酪结合起来,到目前为止益生菌干酪的研究几乎已涉及所有奶酪类型。在本课题中使用的荧光基团是非特异性的SYBR Green染料,它的优点是使用方便不必设计复杂探针,反应灵敏价格便宜。但主要的缺点就是容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性的结果。这就提高了对引物特异性的要求。建议在后续实验中加入叠氮类染料（叠氮溴化丙锭PMA,叠氮溴化乙锭EMA）可以抑制非活性菌体DNA的PCR扩增,这可进一步降低荧光定量PCR法计数时出现的假阳性结果。