[00123589]基于固相PCR的微孔板芯片用于食源性致病菌的新型检测方法的建立

本研究在常见食源性致病菌已有的分子生物学研究的基础上,开发了基于微孔板的固相PCR法,固相PCR反应参考常规PCR反应体系和反应条件,并对硅烷偶联剂浓度、紫外交联时间进行优化。将常规PCR反应的上游引物5’’ 端连上一个15个T碱基的linker后再进行氨基修饰,作为反应的探针被固定于固相载体;经过多次试验,确定固相PCR反应中（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷的添加浓度为3%、紫外交联时间为120min时,探针固定效果良好;反应体系为：2.5umol/L探针2uL固定于96孔板的每一个微孔底部,加入反应模板1uL,上游引物2nmol/L,下游引物200nmol/L,Mg2+浓度为1.5mmol/L,2.5mmol/L的dNTPs 1uL,10×Buffer 2.5uL,Taq酶1U,其他用超纯水补足;反应扩增程序与常规PCR反应一致。固相PCR反应灵敏度与常规PCR相当,均为10-5稀释度。 本芯片以微孔板取代以玻片作为固相的载体,克服玻片载体容易造成反应物之间的污染的缺点,同时加样更加方便。根据固相PCR技术,设计微孔板可视芯片用于诊断食源性致病菌,作为应对突发性的公共卫生事件的检测手段,对保障我国食品的安全也具有一定的实际意义。