[00124072]生化药品中猪、牛、羊源性成分核酸分子鉴定方法

本成果来源为国家药典委员会课题“核酸分子鉴定技术在药品质量控制中的规范化研究”,以核酸分子鉴定技术为基础,建立了一套可用于鉴别形态遭到破坏的生化药物生产原料种属来源的新方法,使种属鉴别从组织器官水平和细胞水平提高到分子水平,摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍,为建立药品质量鉴定规范化标准提供了强有力的科技支撑。 生化药物多为蛋白质、酶类、多糖类等成分,不同动物来源（猪、牛、羊等）的生化药物一级结构及空间结构上有差异（如猪源性肝水解肽及牛源性肝水解肽的肽图有明显差异）,由此带来药效和毒付作用也不同,不同动物来源的药物的疫病风险也不一样。2010年版药典二部凡例中规定,来源于动物组织提取的药物,其所用动物种属要明确,涉及牛源的应取自无牛海绵状脑病地区的健康牛群。分别以肝素、凝血酶及肝水解肽为例说明上述问题,肝素药品可由牛源性及猪源性原料制备得到,牛源性肝素所致的血小板减少症/血栓综合症等不良反应要大于猪源性肝素。猪源性凝血酶中猪蓝耳病病毒的检出率很高,而牛源性凝血酶中未检出该病毒,其原因为该病毒只对猪有感染性,对牛无感染性。以上情况表明只有对生产原料的种属进行有效的鉴别,才能在源头上控制药品的质量。2015年版中国药典在凡例中规定,来源于动物组织提取的药物,其所用动物种属要明确,同时在品种各论的制法要求中也对药品的种属来源做出了限定,如垂体后叶粉应由猪脑垂体后叶制得;肝水解肽应由牛或猪的肝脏制得等。但目前的药品标准中,尚无猪、牛、羊种属鉴别的方法,药典凡例中的有关规定缺乏相应的技术支撑,生产及检测部门对原料的种属鉴别无标准可循。此外,对于生化药品原料而言,经提取、纯化等工艺处理后,已不能用常规的理化方法来鉴别原料的种属来源。本成果建立了猪源、牛源、羊源的PCR鉴别方法,可对生产原料、工艺步骤等样品中残留DNA的种属检测,从源头上控制药品质量,完善药典凡例中有关的各项规定。 本成果对生化药物主要来源动物（猪、牛、羊）的基因核酸序列进行分析,寻找物种间特异性的序列位置,并针对上述位置设计特异性引物,采用聚合酶链式反应技术（PCR）对特异性序列进行扩增,并采用琼脂糖电泳对扩增产物进行长度分析,通过与阳性参考品的比对,对样品的种属来源进行检测,在必要时将针对扩增产物中的限制性内切酶酶切位点,采用相应的限制性内切酶进行酶切,并对酶切产物的片段大小进行分析,进一步提高方法的特异性和准确性。另一方面,针对种间特异性的序列位置设计引物,并在两条引物之间额外设计带有荧光标记的探针,采用实时荧光PCR技术对样品的种属来源进行检测。在上述研究内容的基础上,本成果建立了常规PCR与实时荧光PCR两种鉴别生化药品中猪、牛、羊源性成分的方法,内容包括阳性参考品的制备、样品DNA提取与纯化、常规PCR方法、实时荧光PCR方法以及相应的操作规范等。运用本成果可实现对肝素钠、垂体后叶粉、肝水解肽等生化药品原料及部分工艺中间体的猪、牛、羊源性成分种属鉴别,对动物来源药品的质量监管提供技术支持。