[00124239]黄芩中黄芩苷生物合成关键酶基因的分离与分析

本成果为黑龙江省自然科学基金资助项目。 黄芩为唇形科植物黄芩的根,是我国传统中药。黄芩具有清热、泻火、解毒、止血、安胎等作用,药理作用广泛。黄芩中有效成分黄酮类,具有多种药理作用,其主要作用是抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤、阻止钙离子通道、抑制醛糖还原酶、抗病毒、抗过敏等,并对免疫、心脑血管、消化、神经等系统均有保护作用。 黄芩是黑龙江省重要的药用植物资源。在药用植物学研究领域,黄芩被国外学者称为理想的“药用模式植物”,目前该植物资源日趋匮乏。对此,国内外相继开展了黄芩组织培养、试管苗快速繁殖技术、四倍体育种研究等研究,并采取化学法或生物诱导子等技术,以期提高培养物类黄酮等的水平。但目前报道的类黄酮的代表性物质-黄芩苷的含量仍小于或接近药用根的水平,而且培养物的遗传稳定性差。要从根本上解决这一问题,应从分离黄芩类黄酮合成的关键酶基因入手,揭示类黄酮生物合成的机理,进而从分子生物学角度,探索提高酶活性表达的有效手段和方法,达到显著提高黄芩类黄酮水平的目的。 本项成果采用改进的Trizol法,分别以黄芩细胞悬浮系和发状根为材料,提取的黄芩两种培养物总RNA,并对其纯度和完整性做了分析比较。 以黄芩悬浮细胞系为对照组,以发根农杆菌诱导黄芩产生发状根为试验组,分别获得两者的mRNA后反转录成cDNA,RsaI消化使其平末端化,试验组cDNA的5’末端连接上2个特异接头,然后分别与过量对照组cDNA进行杂交,把两份杂交样品混合后,与过量的新鲜变性的对照组cDNA过夜杂交。杂交后的混合液稀释后进行第一轮抑制性PCR以选择扩增特异表达的cDNA,然后以第一轮PCR产物为模板用巢式引物进行二次抑制性PCR,获得了富集差异表达黄芩不同细胞培养物SSH文库。将SSH文库的cDNA插入到T载体,共获得了236个克隆。BLASTN结果显示：27个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因;另有176个ESTs序列在核酸数据库中存在同源序列,其序列和已知功能（主要是能量代谢、次生代谢、转录因子、衰老及抗病性等）的蛋白有高度相似性。为黄芩苷生物合成关键酶基因的克隆与全序列分析奠定了基础。 本成果在学术思想上,打破孤立地对某一种或两种酶与黄芩苷生物合成的关系进行探讨的局限性思路,从系统研究各种酶的基因表达与黄芩苷生物合成的相互关系的目的出发,首次把抑制差减杂交方法,应用到黄芩苷生物合成关键酶基因的分离与分析上。 在植物组织和细胞培养技术基础上,分离和克隆药用植物次生代谢产物合成的关键酶基因,将有助于药用植物有效生产技术方法的研究,更好地认识和理解药用植物次生代谢途径,提供稳定的、可调控的、高质量的药用植物原材料,对于保护和合理开发我省宝贵药用植物资源具有重要理论和实践意义。