[00124632]香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立

1、课题来源与背景： 本成果由广东省科技厅科技计划项目“香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立（2017A030303044）”资助,项目经费10万元整。 2、技术原理及性能指标： 香蕉（Musa spp.）是一种重要的热带水果和粮食作物。但香蕉遗传育种和香蕉功能基因研究相对滞后。因此,了解香蕉基因组信息及其功能成为重要前提。香蕉A基因组序列测定的完成,为香蕉基因组改造提供了至关重要的踏脚石,对香蕉基因功能的研究起到了极大的推动作用。但香蕉多为三倍体,高度不育,基因功能研究和遗传改良存在诸多技术困难。新的技术手段如CRISPR/Cas9等基因编辑技术的快速发展,为开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟了一条新的路径。在香蕉上应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,实现高效的香蕉基因突变,获得香蕉突变体,将十分有利于香蕉品种遗传改良和功能基因组研究。本成果以香蕉主栽品种巴西蕉雄花序为起始材料,通过优化胚性愈伤诱导条件,诱导更新香蕉胚性细胞系,为香蕉遗传转化提供材料保障。同时,根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene dehydrogenase, PDS）基因组序列,设计Cas9靶点序列,利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-gRNA载体,利用农杆菌转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得再生抗性植株,利用PCR检测和分析再生植株的MaPDS基因被编辑的情况,从而建立香蕉的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系。 3、技术的创造性与先进性： （1）本成果更新获得巴西蕉和大蕉的的胚性细胞悬浮系各1份; （2）本成果首次在香蕉上建立了的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,利用一套改良的CRISPR/Cas9 多靶点载体系统,构建了针对香蕉MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-gRNA基因编辑载体。以巴西蕉的胚性细胞悬浮系为受体,利用农杆菌介导,获得了129个独立的抗潮霉素的抗性再生株系,其中71个株系出现白化表型,产生白化表型几率达55%。被检测的白化株系的MaPDS靶位点及下游附近发生了碱基插入或碱基颠换及转换。本成果成功地在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系。 4、技术的成熟程度,适用范围和安全性： （1）利用本技术,更新获得巴西蕉和大蕉的胚性细胞悬浮系,该技术现适合于香蕉多种资源和品种的胚性愈伤的诱导和胚性细胞悬浮系的建立,现已发展成为较成熟的技术体系,适应于以香蕉雄花序为起始材料的香蕉胚性愈伤的诱导及胚性细胞悬浮系的建立。 （2）CRISPR/Cas9基因编辑系统已作为一种高效的基因定点编辑技术,已成功应用拟南芥、水稻等植物实现了基因组编辑。CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物上取得的重要进展,展示出了巨大的应用潜力。本成果成功在香蕉上建立起了CRISPR/Cas9基因编辑系统。目前在香蕉上建的的基因编辑技术,是建立在农杆菌介导的基础上,该技术目前可用于香蕉突变体的构建,研究香蕉基因功能,为香蕉遗传育种提供技术支撑。 5、应用情况及存在的问题： 本成果更新获得巴西蕉和大蕉的的胚性细胞悬浮系是香蕉细胞工程育种和分子育种的重要材料,正在用于香蕉育种实践中;本成果建立了的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,目前用于香蕉突变体的构建,香蕉基因功能的研究,处于实验室研发阶段。 6、历年获奖情况： 暂无。