[00125250]在DNA水平鉴定绞股蓝并与乌蔹莓区别的方法

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum Makino）是葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物,其有效成分是皂苷,目前已分离的绞股蓝皂苷有80多种,其中6种皂苷与人参皂苷结构相同,是五加科以外少数含人参皂苷的药用植物,全世界绞股蓝有16～17种2个变种,我国共有11种2个变种,主产于我国秦岭山区和江南各省,尤其是西南地区,绞股蓝资源极为丰富,故有“南方人参”的美誉。现代药理学研究证明绞股蓝具有抗肿瘤、降低血脂、抗衰老、护肝等作用。 随着绞股蓝资源的开发,含有相似生药特征的绞股蓝属中不同种相继被证实含有相似的皂苷类型,可扩充为药用植物资源。但市场上绞股蓝属药材来源复杂,质量差异显著,常见的混淆品主要包括乌蔹莓、雪胆、崖爬藤等,其中乌蔹莓（Cayratia japonica （Thunb.） Gagnep）最易与绞股蓝混淆,因其具有与绞股蓝属十分相似的生境与形态特征,易造成药材采收的混乱。 当前,对绞股蓝与乌蔹莓进行鉴别研究已有大量的文献报道,如刘天学等从植物形态特征、化学成分与药理作用、采集加工与简要用法等方面对绞股蓝与乌蔹莓进行了鉴别;马成亮从分类归属、性状特征、名称、分布区域等方面进行鉴别;程存归等使用FTIR法直接对二者进行鉴定;王太霞等对绞股蓝与乌蔹莓药用部分进行显微鉴别;杜丽君等从性状、解剖结构、现代研究等方面对绞股蓝与乌蔹莓进行鉴定;王翀等使用PCR-RFLP方法从分子水平上对绞股蓝和乌蔹莓进行鉴别以及蒋军富等通过RAPD指纹图谱从分子水平上鉴定绞股蓝和乌蔹莓。 本次成果属于一种用于葫芦科绞股蓝属药用植物绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）鉴定的DNA分析方法。其特征在于,采用随机引物扩增多态性法（Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD）,分析药用植物绞股蓝的多态性及其特征。利用生物信息学方法挑选出20条10mer RAPD随机引物,其中19条均能有效扩增绞股蓝基因组DNA,获得的RAPD指纹图谱清晰,多态性较高;同时也呈现少数绞股蓝共有条带。这19条引物扩增的DNA条带分子量在约200～5000bp之间。通过分析所扩增得到的绞股蓝RAPD指纹图谱,找出两个绞股蓝共有的分子标记（长度分别为500bp和750bp）,分别命名为J-500和J-750。对8份不同来源的绞股蓝DNA扩增得到的J-750标记进行了克隆并测序分析,经采用NCBI（National Centre of Biological Information）Blast 软件分析,发现8份不同来源的绞股蓝J-750均为一段新克隆的尚未在NCBI登录的植物DNA序列。利用Oligo 6软件针对绞股蓝分子标记J-750设计特异引物,将RAPD标记转化为SCAR标记;利用SCAR标记结合18S rRNA基因,采用PCR技术准确鉴别出绞股蓝,并能与植物形态上与绞股蓝相似的葡萄科的乌蔹莓（Cayratia japonica）相区别。