[00125534]半夏凝集素基因克隆及抗虫种质资源创新

简要技术说明：　　甘肃省科技厅《半夏凝集素基因克隆及抗虫种质资源创新》项目（合同编号QS031-C31-15）于2003年下达，经过6年多的不懈努力，完成合同各项任务指标，取得了以下主要成果：　　1.根据植物凝集素基因同源序列设计特异引物，以甘肃特有的西和半夏为供体材料，克隆了1069bp的半夏凝集素基因并注册到GeneBank(AY725425)，构建了以pBI121为基础载体的半夏凝集素基因植物表达载体。　　2.建立了农杆菌介导的油菜、烟草两种作物的遗传转化体系和花粉管通道法介导的棉花转化体系，经PCR分析获得了三种作物的转基因工程植株，其中油菜3株、烟草14株、棉花6株。　　3.通过农杆菌介导法实现了半夏凝集素基因对模式植物烟草的遗传转化，试验中对烟草外植体的高效再生和遗传转化条件进了优化；经PCR分子鉴定和抗蚜性分析认为，外源PTA基因已经整合到烟草的基因组中，并得到了有效表达，其控制编码的半夏凝集素对蚜虫有一定的抑制作用。转基因烟草株系蚜口密度抑制率从28.9﹪～69.7﹪不等，平均蚜口密度抑制率为42.7﹪。　　4.对油菜转基因植株进行了常规PCR和荧光实时定量PCR两种分析方法，以SYBR Green Ⅰ为荧光染料，以1069bp pta序列中高度保守区域内145bp的片段为目的基因（简称145-pta），磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（pep）为内参基因进行分析，两种分析方法结论一致。对油菜抗性植株进行了培养基诱导生根和自来水自然培养两种生根方式的研究，比较得出自来水自然培养所需时间短（15d），无需炼苗，移栽成活率(100﹪)高。　　5.在伏蚜期以田间自然虫源为准，调查单株蚜量，进行大田抗蚜性分析，结果表明k9505转化植株对棉蚜表现中抗水平，抗性植株蚜害减退率较对照高10﹪。对转基因棉花后代材料进行了Kan筛选浓度和快速筛选方法的研究，结果表明采用6000mg/L Kan涂抹第一片真叶为可有效筛选转pta棉花后代材料，PCR结果表明部分抗性植株检测出NPTⅡ标记基因，而非抗性植株未检测到NPTⅡ基因。　　推广应用前景：　　该研究以转基因技术为研究手段，对模式植物烟草以及甘肃省的两大经济作物棉花、油菜进行了花粉管通道法和农杆菌介导的遗传转化研究，通过严格的实验程序获得了经PCR鉴定的转基因植株。经转基因农产品安全性评估后，有望提交育种单位进行棉花、油菜抗虫品种的培育，对提高农作物产量和品质、减少农药用量和保护生态环境具有重要的意义。