[00125748]合成抗感染先导化合物llamycin的关键CYP450酶底物识别及催化机制研究

本课题属地方计划项目,课题来源广东省科学技术厅,为单一来源经费投入,在研期间未获得其他经费资助。课题以中国南海深海放线菌S. tratus SCSIO ZH16中分离到的强效抗结核先导化合物岛霉素ilamycin为基础,以其活性相关3个结构单元对应的生物合成酶为研究对象,开展底物识别与催化机制研究。我国是结核病高负担国,WHO评估中国年发病人数位居全球第二,结核防控治疗花费巨大,面对耐药类型结核病逐年上升趋势,迫切需要加强新药的研发。岛霉素属于七元环肽化合物,其抗结核活性显著高于一线临床抗结核药物利福平,是一种潜力显著的药用先导化合物。环肽是药用先导化合物的重要来源,揭示环肽的生物合成酶催化机制,有助于指导组合生物合成进行多肽类活性物质修饰改造,拓展和创新有成药潜力的环肽衍生物。岛霉素家族已经发现20个衍生物,活性各不相同,其中活性最好的ilamycin E在野生型菌株中并非主要产物。基因敲出、回补等生物合成分析显示活性衍生物的累积受修饰酶的影响,修饰酶促使高活性衍生物转化成弱活性的衍生物,掌握该化合物的功能基因与合成代谢的关系,人工按照需求控制代谢流,指导组合生物合成技术对ilamycin的结构修饰和改造,构建功能基因突变菌,有助于加速新化合物的产生和高产工程菌的获得。 本课题以探究酶催化岛霉素生物合成细节为主要研究目标,在解决基础科学问题基础上,力求为组合生物合成技术开展多肽类活性物质修饰改造、新药研究开发、构建稳定高产的岛霉素生产菌株等提供理论和技术支撑。课题涉及3个研究对象,负责岛霉素及其衍生物的合成和修饰,是岛霉素生产菌株合成结核岛霉素衍生物的重要酶。系统研究并掌握其生物合成酶催化过程具有重要科学意义。基因敲出、回补研究及生物信息学分析证实环氧化酶（IlaR）、甲基羧化酶（IlaL）及酪氨酸硝基氧化酶（IlaN）三种参与岛霉素的合成与修饰,三种酶均属细胞色素P450酶,同为古老的亚铁血红蛋白家族,以血红素作为辅因子,都含有保守的血红素结合残基。酶的三维结构决定其功能,采用结构生物学和生物化学为主要研究手段,系统开展酶学及晶体结构研究,明确了该系列酶可溶性表达和纯化策略、获得高质量晶体并解析了环氧化酶（IlaR,2.7 ）及酪氨酸硝基氧化酶（IlaN,2.1 ）三维结构,通过结构及生化研究分析明确了两种酶之间利用骨架的相似性、柔性环区的长度和构象差异性及活性中心口大小等精细结构直接影响其底物的特异性。其中,硝基化是生物催化中较少有反应类型,酪氨酸硝基氧化酶IlaN是目前发现的第二种芳香族氨基酸硝基化酶,该结构的解析对系统探讨芳香族氨基酸硝基化具有重要价值,进一步对酪氨酸硝基氧化酶IlaN进行了酶-底物及酶-产物分子对接计算,鉴别IlaN对底物酪氨酸及产物3-硝基酪氨酸识别和催化的可能关键残基。针对环氧化酶IlaR结构的分析,初步明确了对其不同底物识别的结构基础,有助于指导人工酶的开发,保障岛霉素成药性研究。 本研究选择我们分离自中国南海深海,具有自主知识产权的特色菌株,立足该资源菌株深入系统的研究岛霉素的生物合成酶催化细节,特别是选择影响高抗结核活性衍生物产量的3种氧化修饰酶作为研究对象,资源有保障,选题立足结核耐药菌引发的新药需求,创新性好,在岛霉素及其衍生物药用资源的开发利用方面更具优势。研究针对岛霉素3种氧化酶底物多样性的特征,基于结构决定功能思想,最先运用酶学、蛋白质晶体学技术对岛霉素修饰功能基因/酶开展研究,并首次解析了岛霉素重要结构单元生物合成酶IlaR和IlaN的三维结构。通过认识该系列修饰酶结构特征,精准揭示岛霉素的生物合成的细节,为专一、高产酶类生物催化剂的开发,岛霉素及其衍生物的改造及其新药的开发提供理论和技术支撑,有力的保障了岛霉素及其衍生先导药物的开发。 项目属基础探索性研究,项目目前未获直接经济及社会效益。岛霉素具有较强抗结核活性,具有药用开发潜力。本项目的3个研究对象参与岛霉素及其衍生物的合成和修饰,是岛霉素生产菌株合成结核岛霉素衍生物的重要酶,我们系统开展上述酶的表达纯化及酶学特征分析,首次解析了岛霉素重要结构单元生物合成酶IlaR和IlaN的三维结构。本项目的开展,为进一步阐明岛霉素合成酶催化机制,开发酶类生物催化剂及多肽类先导化合物的改造提供技术和理论支撑。在解决基础科学问题基础上,后续我们将立足获取高选择性的人工酶突变体的研发,结合微生物来源药物组合生物合成技术,为高抗结核活性岛霉素衍生物的制备提供可能,确保提供充足岛霉素稳定其下游成药性研究及转化应用工作,具有较好的社会和经济价值预期。本项目在研期间未获得任何奖励。