[00127411]等温扩增检测基因mecA方法的建立及其应用

1、课题来源：　　自选项目　　2、应用领域和技术原理：　基因检测法则是一种快速灵敏的检测方法，比其他方法可提前24～48小时。MRSA耐药机制主要是由于金葡菌表面青霉素结合蛋白(PBP) 发生了变化所致，MRSA增加了一种分子量为78 000 的PBP，命名为PBP2a，它与β-内酰胺类抗生素亲和力极低。当β-内酰胺类抗生素存在的条件下，其他PBPs 被抑制，不能发挥效能，而PBP2a 仍可发挥作用，继续完成细菌细胞壁的合成，使细菌得以生存。PBP2a 只存在于MRSA 细菌表面，不存在于敏感金葡菌，由位于mec 片段上的mec A基因编码。MRSA菌株与β-内酰胺类抗生素结合后，使mec A基因被诱导活化，进行转录产生PBP2a，临床上表现为耐药。通过检测导致葡萄球菌对甲氧西林耐药的主要mec基因，可以准确判断菌株耐药与否。但目前基因检测技术方法仅对临床分离培养后的葡萄球菌进行检测，而对临床标本的检测准确率并不高。为了进一步提高基因法的灵敏性，使基因检测成为更加简便、快速、准确的检测方法，我们设计了多重分子信标和LAMP等温扩增相结合的检测MRSA方法，可以快速，准确地直接检测临床样品MRSA，整个试验时间只需不到2h。　　3、性能指标：LAMP(Loop-mediated isothermal amplifica-tion)即环介导等温扩增，是一种新型高效特异的等温基因扩增技术[12]，其DNA扩增产物是一系列由基本扩增片段连接而成的长度不同的双链DNA， 最短的扩增产物为基本扩增片段。基本扩增片段的两端有环形结构，扩增引物以及分子信标荧光探针可以与环形结构区的DNA互补序列结合，进行扩增或杂交检测。该扩增方法是用四条引物与六个不同的DNA区域特异结合实现扩增，因此，具有高特异性，同时具有等温快速扩增的特点，可以在1h内，将靶DNA片断扩增10^9。由于高特异性，其扩增产物可以不需杂交探针直接通过产物的荧光或电泳条带的有无来判断结果，但是，建立多重LAMP，同时在一个反应管中扩增两个基因片段，扩增结果则需要用标有不同荧光素的两种探针进行杂交检测，由于分子信标荧光探针可以和扩增产物的环形DNA区结合，结合后的探针产生两种不同的荧光。建立的方法检测MRSA的最低检出量可以达到10cfu/ml。　　4、与国外同类技术比较：经文献检索(1)该课题研究的采用多重环介导的等温扩增技术（LAMP）与分子信标探针相结合进行快速、多重基因检测方法，目前国内外均未查到相同的文献报道。(2)本文实验证明：该扩增方法是用四条引物与六个不同的DNA区域特异结合实现扩增，因此，具有高特异性，同时具有等温快速扩增的特点，可以在1h内，将靶DNA片断扩增10^9。由于高特异性，其扩增产物可以不需杂交探针直接通过产物的荧光或电泳条带的有无来判断结果。而且缩短了时间。其结果与直接测序结果相吻合，体现了该方法快速，特异性强的优越性。5、成果的创造性、先进性：(1) 本文关于“等温扩增检测基因mecA方法的建立及其临床应用”，填补了国内在此方面研究的空白。(2) 应用免疫磁珠技术，采用抗青霉素结合蛋白2a（PBP2a）单克隆抗体包被的慈珠，分离并制备葡萄球菌富集微珠。(3) 所建立的免疫磁珠富集-多重荧光探针LAMP等温扩增方法可以直接快速检测临床标本中的MRSA，是一种有应用价值的快速MRSA基因检测的方法。　　一、作用及意义：自20世纪60年代在欧美首先发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)医院感染以来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的比例越来越高，已成为医院感染重要的致病菌之一，因其治疗困难，病死率高，引起了国内外的广泛关注。MRSA感染、乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征被列为世界范围内三大最难解决的感染性疾患。因此，进行快速、准确检测mecA介导的耐药葡萄球菌，对我国广大基层医院的预防耐药葡萄球菌的感染具有现实意义。 　　二、推广应用范围、条件和前景。目前临床上采用的方法主要有：(1) K-B法：用含4%NaClrM-H培养基作1ug/片苯唑西林的纸片法药敏试验。(2) 琼脂筛选法：用添加6ug/ml苯唑西林于4%NaCl内的M-H培养基，作0.5麦氏单位菌悬液点种试验，35℃孵育足24h观察结果。(3) Vitek全自动微生物鉴定仪(MIC法)：用GPI(革兰氏阳性球菌鉴定卡)鉴定葡萄球菌菌种，GPS-107(革兰氏阳性球菌药敏卡)作药敏试验，所测得MIC值(最小抑菌浓度)。(4) 胶乳凝集试验：采用包被有抗PBP2a(青霉素亲和蛋白2a)的胶乳颗粒。(5) 基因检测法：检测产生耐药性的基因。比较上述五种方法，K-B法、琼脂筛选法、MIC法耗时较长，并受抗生素、培养温度、菌液浓度、平皿厚度及试剂质量等多方面条件限制，尤其为琼脂筛选法需添加6ug/ml苯唑西林，量少较为麻烦，且判断结果带有主观性。用Vitek系统检测MR-SA与MRS，测得其MIC值作结果判断，但仪器昂贵、试剂卡价格高。胶乳凝集试验采用包被有抗PBP2a单克隆抗体的胶乳颗粒，直接检测PBP2a，是目前临床所采用的MRSA检测方法中灵敏度最接近MecA基因检测的方法，仅需经几个简单的前期处理步骤，15min内即可判断受检菌落是否为MRSA，较传统法或MIC法缩短24h，但该方法同样存在较大的主观性，同时仅能对分离培养好的菌落进行检测，而对临床标本则无能为力。　　(1) 基因检测法则是一种快速灵敏的检测方法，比其他方法可提前24～48小时。MRSA耐药机制主要是由于金葡菌表面青霉素结合蛋白(PBP) 发生了变化所致，MRSA增加了一种分子量为78 000 的PBP，命名为PBP2a，它与β-内酰胺类抗生素亲和力极低。当β-内酰胺类抗生素存在的条件下，其他PBPs 被抑制，不能发挥效能，而PBP2a 仍可发挥作用，继续完成细菌细胞壁的合成，使细菌得以生存。PBP2a 只存在于MRSA 细菌表面，不存在于敏感金葡菌，由位于mec 片段上的mec A基因编码。MRSA菌株与β-内酰胺类抗生素结合后，使mec A基因被诱导活化，进行转录产生PBP2a，临床上表现为耐药。通过检测导致葡萄球菌对甲氧西林耐药的主要mec基因，可以准确判断菌株耐药与否。　　(2) 为了进一步提高基因法的灵敏性，使基因检测成为更加简便、快速、准确的检测方法，我们设计了多重分子信标和LAMP等温扩增相结合的检测MRSA方法，可以快速，准确地直接检测临床样品MRSA，整个试验时间只需不到2h。 　　(3) 建立直接快速检测临床标本中MRSA的基因检测方法，首先需要解决的问题是对各种临床标本的处理问题。　　临床标本主要存在两个问题：　　一是采集的标本中致病菌可能很少，处理时容易丢失；　　二是临床标本中含有大量的杂质成分，必须进行复杂的提取DNA操作， 才能提取到有效纯度的DNA模板。这些都影响对临床标本中MRSA的快速直接基因检测。为此我们采用免疫磁珠富集方法解决上面问题，首先对标本进行离心洗涤，初步除去标本中的小分子，如蛋白分子，然后用免疫磁珠对标本中的金黄色葡萄球菌进行富集，由于绝大多数金黄色葡萄球菌表达SPA，我们利用固定有SPA单抗的磁珠结合标本中的金黄色葡萄球菌进行磁珠富集，然后用简单的煮沸法提取金黄色葡萄球菌DNA， 实验证明该富集方法具有操作简便快速，特异性强，富集率高。目前研究临床标本中MRSA的快速直接基因检测单位仅1～2个科研单位，试剂昂贵（做一人需200元），患者难以接受。研制新的实验方法有着较好的经济效益，一人份仅需50～70元。