[00127993]分子灯标：三苯甲基保护的巯烷臂寡核苷酸的合成及荧光标记

该课题系上海市教育委员会重点学科研究项目“分子灯标技术的开发研究”中获得的阶段性成果。主要从事工作是研制了一种三苯甲基保护的巯基乙醇亚磷酰胺试剂，用它合成了一条C2长的巯基臂寡核苷酸。在Ag+和DTT作用下脱去三苯甲基的保护后与w-碘己基修饰的荧光基团反应，得到一条相应的荧光标记的寡核苷酸探针。这种荧光探针在筛选基因文库，检测分子遗传疾病等方面有着重要的应用；标记不同荧光基团的探针可以作为测序引物；在它基础上开发的分子灯标是当前国际定量PCR液相实时检测探针。得到的亚磷酰胺试剂纯度大于99%；合成的寡核苷酸荧光探针溶液1ml（1pmol）做变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在紫外365nm波长下肉眼可观察到一条明亮的荧光条带；杂交靶基因最低检测量为1pmol。这种两步标记的方法操作简单成本低廉，目前市场上使用的连接臂通常为六或七个碳长的氨基臂或巯基臂，尚无这种二碳长的巯烷臂连接试剂生产。生产中利用巯基乙醇为原料的合成方法尚无报道。目前国内有许多家从事DNA合成的公司，竞争相当激烈。DNA合成价格已从两年前的10元/碱基降到7元/碱基，但要进行某些特殊修饰的价格还是较高的，如3´、5´加磷酸要300元，巯烷臂或氨烷臂修饰要500元，倘若再结合上荧光素或地高辛等化合物那更是价格不菲。这主要是因为DNA合成中用到的亚磷酰胺试剂易氧化不易保存，而目前所用试剂完全依赖进口。我们开发的这种三苯甲基保护的巯烷臂亚磷酰胺试剂就是一种寡核苷酸末端修饰试剂，有望以此替代进口。用该试剂生产的荧光探针与地高辛杂交系统比较具有操作简便，成本低的优点，缺点在于不够灵敏，本底高。可以选用其它发光强度较强的荧光基团来改进，另外我们设想用红外激发荧光试剂替代以减少本底干扰。鉴定项目“分子灯标技术的开发研究”是上海市教委资助的重点学科建设项目，已完成合同规定的考核指标，技术资料齐全，符合鉴定要求。该项目的技术难点在于，荧光连接臂的合成和灵敏荧光染料的标记。通过一个亚磷酰胺试剂在固相合成仪上合成一条5´末端带三苯甲基保护的巯烷臂寡核苷酸链，从而构建了分子灯标合成的骨架；该亚磷酰胺试剂在国际上尚无商品化；新型荧光染料在荧光标记中表现了较高的结合率，具有较高的荧光发光强度。这两项合成技术为制备分子灯标试剂国产化，既可降低合成费用，同时也将促进实际应用，达到国际先进水平。该项目具有很好的应用开发前景。合成得到的单链荧光探针在检测灵敏性上可以达到1pmol靶基因的最低检测量，接近同类荧光杂交探针的水平，与地高辛标记相比可靠性高，也避免了同位素标记的放射性危害。该探针在检测林肯霉素生物合成基因lmbH中得到了应用。结合当前生物芯片的应用，相信未来在病毒检测、病菌特征序列分析、肿瘤基因序列检测等应用领域有重要发展前景。鉴定委员会一致同意通过鉴定。建议进一步争取获得资助，深入研究提高荧光染料灵敏度，尽早实现产业化。