[00128185]利用基因重组技术提高海藻糖合酶活性及酶制备工艺优化

2006年《利用基因重组技术提高海藻糖合酶活性及酶制备工艺优化》获得了天津市应用基础及前沿技术研究计划重点项目资助，项目编号为：06YFJZJC02100，项目起止时间为2006.4～2008.12，取得的主要成果： 1.通过G+C%含量、DNA-DNA杂交、各种生理生化指标及16S rDNA序列，确定CBS-01菌株为红色亚栖热菌。 2.获得了该菌海藻糖合成途径中的otsA、otsB以及treS三个基因，长度分别为1350bp、690bp、2889bp。Genbank号分别为Genbank NO.EU443098、FJ360766、FJ360767。 3.构建pET-21aTreS1.6k、2.1k、2.5k、2.9k、pET-25bTreS、pET-28aTreS、pET-32aTreS、pPIC9K-2.9k、pPIC3.5K-2.9k等表达载体，分别转化受体菌E.coliBL21、Rosetta gami(DE3)、P.pastoris GS115，筛选到pET-21a在Rosetta gami中可有效地表达海藻糖合酶。 4.通过PCR定点突变技术，将海藻糖合酶基因的+6-+12和+51-+58位的核苷酸加以改造，使其不能和载体pET-21a上的SD序列紧密结合，大幅度提高了该酶在大肠杆菌中的表达量。 5.对基因工程菌株进行培养条件优化，20℃诱导过夜，IPTG的终浓度为0.5mmol/L，并适当减少通气量，可获得更多的可溶且有活性的目的蛋白。 6.通过NTA-Ni柱对重组蛋白进行纯化，其分子量约为110kDa。利用Bradford法测定纯化酶液的蛋白含量，约为1.05mg/ml。以2%麦芽糖为底物，测定纯酶的酶活约为80U/mg。 7.重组蛋白反应的最适温度50℃，最适pH6.0～7.0，该酶4～60℃和pH4.0～8.5范围内都极其稳定，60℃中处理5h后，残余酶活仍然能够达到90%以上，而且4℃冷藏保存对该酶的活性几乎不产生影响（2个月内），酶活提高了7倍。证明该酶非常适合工业化生产海藻糖。 8.初步研究了M.ruber海藻糖合酶基因的结构与功能。通过缺失突变，发现C-端的缺失造成海藻糖合酶功能的丧失。同时发现TreS属于α-淀粉酶家族成员，具有四个保守区。通过三维模型的构建与活性区域分析的方法，对三个保守程度较高的氨基酸位点：D200、R227、R392进行了定点饱和突变及定点突变，发现D200G/H163R与R392A的突变对酶的能力产生重大影响。 9.将克隆到的otsA、otsB基因也进行了表达和纯化，利用薄层层析的方法验证了这两个酶的活性。同时，检测了红色亚栖热菌在各种环境压力下细胞内含物成分的变化情况，发现在高渗环境压力的诱导下，该菌会在胞内积累大量的6-磷酸海藻糖，而并非海藻糖，这为进一步研究TPS/TPP和TreS途径在细胞体内的作用奠定了基础。 创新性： 1.这是国内外首次在亚栖热菌中发现产海藻糖合酶的菌株，比其他常温菌更具有工业应用价值。 2.国内外首次克隆亚栖热菌的基因序列；并利用分子生物学的方法对海藻糖合酶基因进行遗传学改造，为嗜热菌分子生物学育种提供借鉴技术，具有创新性。 3.提供了新的产海藻糖合酶的高产基因工程菌株，产业化前景很好。