[00130375]花椰菜花球变紫定性定量分析及相关基因表达研究

本项目为青年科研人员创新研究与实验项目 （一）研究内容和任务 1．花椰菜花球变紫定性定量分析 借鉴前人研究成果,利用分光光度方法测定白花球变紫前后花青素含量变化,明确花球变紫原因。（初步完成） 利用高效液相色谱（HPLC-DAD）分析方法,进行花球变紫后花青素定性分析,明确花球变紫后花青素种类。 2．花椰菜花球变紫候选基因分析 以变紫前后花椰菜花球组织以及相同发育时期纯白花椰菜花球组织为试验对象,进行转录组测序和生物信息学分析,推测导致花椰菜花球变紫的候选基因。 3．花椰菜花球变紫关键基因挖掘 收集花球变紫材料不同发育阶段植物组织,利用实时荧光定量PCR技术研究候选基因表达模式,分析白色花球变紫候选基因。 4．花椰菜花球变紫关键基因验证 克隆候选基因全长序列,构建表达载体,转化纯白花椰菜植株,验证候选基因功能。结合表达模式和遗传转化分析结果,明确花球变紫关键基因。 （二）考核指标 1．明确花椰菜花球变紫的原因。 2．获得花椰菜花球变紫定性定量结果。 3．获得花椰菜花球变紫的关键基因。 4．在国内核心期刊发表论文2篇。 （三）合同指标完成情况 1．明确了花青素累积是花椰菜花球变紫的原因 利用酶联免疫方法测定了花椰菜花球变紫前后花青素含量变化,说明花青素含量增加是花球变紫的原因。 2．测定出3种花青素成分与花球变紫具有相关性 利用高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法测定了花球变紫前后代谢物,共检测出10种花青素成分。通过主成分分析表明：芍药素O-己糖苷、矢车菊素半乳糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖甙氯化物与花球变紫具有较强相关性。 3．挖掘出花球变紫的候选基因 进行转录组测序和生物信息学分析,发现花青素结构基因DFR、ANS和UGT上调表达,转录因子TT8、GL3、EGL3、PAP2和TTG1在变紫花球中也同时高表达。利用荧光定量PCR分析方法验证了DFR、ANS和PAP2在花球变紫和不变紫色材料中表达差异显著,因此将这3个基因作为候选基因进行过表达和基因编辑验证。 4．转录因子PAP2和花青素结构基因ANS为花球变紫关键基因 利用成功构建的花椰菜遗传转化体系以花球变紫材料’’FQ-36’’DNA为模板,克隆PAP2基因序列,构建表达载体转化纯白花球花椰菜野生型材料’’ZH-2’’,成功获得了阳性株系。根据DFR、ANS基因序列信息,构建了基于CRISPR-Cas9体系的基因编辑载体,得到ANS基因功能缺失突变体。 5．核心期刊发表论文2篇。