[00130452]抗肝癌药物精氨酸脱亚胺酶等生物医药关键酶的筛选和分子改造研究

1. 精氨酸脱亚胺酶的抗癌活性和分子改造研究 肝细胞癌是现在世界上病发率最高的癌症之一,有效治疗肝癌的方法是全世界的一个研究热点。精氨酸脱亚氨酶（ADI）是一种极具潜力的用于治疗精氨酸缺陷型肿瘤（如：肝癌、黑素瘤等）的抗癌新药,目前该酶（ADI-PEG-20形式）用于治疗肝癌和黑素瘤的第三期人体临床实验正在进行中,预计于2013年内完成。该抗癌药物在全球市场的销售额预计可达到30亿美元。 本研究对来源于自主筛选的变形假单胞菌的精氨酸脱亚氨酶进行了抗癌活性研究并对其进行定向进化,通过建立快速的平板筛选模型,获得一株具有较高ADI活性的变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039;首次克隆了P. plecoglossicida的ADI基因,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,并对其进行纯化及酶学性质研究;首次建立了简便灵敏的精氨酸脱亚胺酶高通量筛选模型,采用易错PCR法构建突变文库,最终筛选获得了更适用于体内中性环境并具有高活性和低Km值的ADI突变株M314,其在生理pH条件下的酶活力提高了20.5倍,最适pH由6.0提高至6.5。为进一步探究ADI的关键氨基酸残基对其酶活的影响机制,本研究基于该蛋白质结构同源建模选取多个热点氨基酸位点进行定点突变研究。结果表明,R18L、D38H、D44E、S245D、E296K对该酶在生理中性pH条件下的酶活有一定的促进作用。在M314的基础上,突变株M13（D38H/A128T/E296K/H404R/I410L）在生理中性pH条件下的比酶活提高了58﹪,Km也有所降低。更重要的是,突变位点S245D的引入使突变株M314的最适pH由6.5进一步提高至7.0,比酶活也有显著提高（63﹪）,使ADI作为潜在的抗癌药物更适应体内的生理中性环境。本研究将为该抗癌药物的应用提供具有优良酶活和酶学性质的ADI突变株,为阐明ADI的酶活机制和蛋白质的理性改造提供依据,并为开发具有自主知识产权的抗癌新药奠定基础。 2. 制备芳基手性醇类医药中间体的关键羰基还原酶的筛选和应用研究 芳基手性醇及其衍生物具有特殊光学及生物活性,是重要的手性药物、农用化学品、精细化学品以及液晶材料的手性中间体。利用生物催制备手性化合物已经成为国内外研究的主要趋势。由氧化还原酶催化的不对称氧化还原反应制备手性醇,是国内外生物转化的主要研究方向之一,利用不对称还原反应制备手性醇的文献报道已较多,其中真正实现产业化的实例甚少。 本研究以典型的生物催化不对称还原反应方法制备芳基手性醇类化合物为研究对象,即不对称还原反应制备（R）-2-氯-1-（3-氯苯基）乙醇、（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯、（S）-（4-氯苯基）-（吡啶-2-基）-甲醇等一系列芳基手性醇,对生物催化不对称还原反应制备手性芳基醇类化合物进行深入的应用基础研究,获得多个具有自主知识产权的高立体选择性、高稳定性的氧化还原酶产生菌;建立高立体选择性、低成本、高效稳定的生物转化合成具有重要应用前景的手性芳基醇的工艺过程。（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯（R-HPBE）是合成众多血管紧张肽转化酶抑制剂普利类系列的关键手性中间体,如赖诺普利,依那普利等,用于治疗高血压和充血性心肌衰竭等心血管疾病。（S）-（4-氯苯基）-（吡啶-2-基）-甲醇是用于合成抗过敏药物倍他司汀的重要手性中间体。本研究首次实现了微生物细胞催化不对称还原合成该产品,并通过采用PEG4000/Na2HPO4双水相反应体系,显著改善了微生物细胞催化剂的底物耐受性和生物相容性,建立了绿色、高效的生物转化工艺过程。（R）-2-氯-1-（3-氯苯基）乙醇是β3肾上腺素受体激动剂（β3-AR激动剂）的通用中间体,可用于合成在抗抑郁、抗肥胖、抗糖尿病等方面有显著的疗效的β3-AR激动剂类药物。本研究完成了生物催化不对称还原制备（R）-2-氯-1-（3-氯苯基）乙醇的100 L中试（公斤级）规模生产线,建立了方便易行、经济的产物提取与精制工艺,产品达到药用级或FCC要求。实验规模（100L反应器Kg级产品）、产物浓度（20g/L～30g/L）、转化率（99.2﹪～ 100﹪）、产品质量（含量99.1﹪,光学纯度99.8﹪）、提取收率高（92.5﹪）等方面,整体水平处于国际领先。