[00130454]具有高刺激分泌的胃泌素17（G-17）单克隆抗体

一、背景 胃泌素是一种重要的胃肠道肽类激素,于1905年由英国学者Edkins首先发现并命名。胃泌素由位于胃窦及十二指肠近端黏膜的G细胞合成及分泌。其合成经历了由胃泌素原、甘氨酸延伸型胃泌素到成熟胃泌素的阶段,前两种胃泌素合成的中间产物是未酰胺化的胃泌素,而成熟胃泌素是酰胺化的胃泌素,人体中95％以上的活性胃泌素为α-酰胺胃泌素。酰胺化胃泌素包括G17、G34、G14、G6、G52、G71,其中G17是胃窦中胃泌素的主要形式,为进餐后血液中胃泌素的主要形式,G34是十二指肠中胃泌素的主要形式,是介于两餐之间胃泌素的主要形式。胃泌素与胃泌素受体结合后通过一系列信号转导而发挥生物学效应。胃泌素与胆囊收缩素具有相同的羧基末端五肽序列,因此其受体与胆囊收缩素受体（cholecystokinin receptor, CCKR）完全相同,故胃泌素受体也称CCKR。CCKR主要有CCK-A受体和CCK-B受体两种,胃泌素主要通过与CCK-B受体结合发挥生物学效应。 在慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis,CAG）中,血清G17与胃黏膜萎缩部位及萎缩程度具有相关性。Cao等在一项病例对照研究中发现胃窦萎缩组的血清G17比对照组低,胃体萎缩组的血清G17比对照组高,多灶性萎缩组的血清G17比对照组低,但高于胃窦组。分析其原因可能为胃窦萎缩时,G细胞数量较少,G17合成降低;胃体萎缩时,泌酸细胞数量减少,胃内处于低酸状态,由胃泌素胃酸轴负反馈导致胃泌素升高。范玉林等研究将胃黏膜轻、中和重度萎缩组分别与正常对照组比较,血清G17 含量在胃黏膜轻度萎缩时显著增高,中度萎缩时无显著差异,重度萎缩时显著降低;与正常对照组比较,G细胞数量在胃黏膜轻度萎缩时无显著差异。而在胃黏膜中、重度萎缩时则显著降低。 二、研究内容 （1）关于制备鼠单克隆抗体的研究 用重组蛋白免疫6-8周龄体重＞20 g的 BALB/c雌性小鼠。即G-17重组蛋白100 μg/只与福氏完全佐剂混合,充分乳化后,经背腹部皮下多点注射0.3 mL/只,后每间隔2周,取80 μg/只抗原和福氏不完全佐剂充分乳化后,腹腔注射0.3 mL/只,免疫第4次的一周后,对小鼠进行眼球取血,检测血清效价。 （2）关于单克隆抗体的分型鉴定方法的研究 运用间接法原理先用羊抗鼠IgG在96孔板上包被固相,然后加入待测的杂交瘤细胞培养上清液,培养上清液中的目标抗体便会与96孔板上固相结合,洗板去除游离物质,然后加入用于特异性标记二抗孵育,洗板去除游离物质,加入显色底物显色,在450nm处测定OD值,进行定性及定量分析。 三、关键技术 1)单克隆抗体腹水制备及纯化技术：通过特定的制备工艺操作流程下,在规定条件下,流动透析24h后即获纯化的腹水抗体。 2)抗体标记技术：在HRP-蒸馏水溶液中再加入NaIO4溶液,混匀后置于特定避光条件下。加入乙二醇溶液,室温避光条件下轻微搅拌。加入的抗体溶液,混合均匀后装入透析袋中,置于CBS溶液中避光条件下透析。 3)亚型亚类检测技术：采用分型鉴定方法,使用抗体分型鉴定试剂盒SBA,规定条件下,在ELISA平台检测得出鉴定结果。 四、创新点 创新点一：自主设计了具有高刺激分泌的胃泌素 17（G-17）单克隆抗体制备方法,通过取 1 倍体积腹水加 2 倍体积 0.06 M pH 4.8 醋酸-醋酸钠缓冲液稀释,室温下边搅拌边加辛酸 （30 μL/mL 腹水）,室温搅拌30min,12000 rpm 离心 20 min,收集上清,再用 50%饱和硫酸铵沉淀,室温搅拌30min,4℃放置 2 h,12000 rpm 离心 20 min,沉淀用 2倍体积的 PBS 溶液溶解,在 4 ℃流动透析 24 h 后即获纯化的腹水抗体,于-20 ℃保存。 创新点二：通过研究G-17 为 17 肽小分子结构,在没办法获取天然抗原和对照抗体的条件下,仅有的低值血清标本来对抗体进行双抗体夹心筛选并获得可配对抗体。GN 抗原的氨基酸序列为： Pro-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu ; GC 抗 原 的 氨 基 酸 序 列 为 ：Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2,该制备的单克隆抗体,能够有效应用于药物制备中,增加了药物的靶向性和特异性。 创新点三：设计了一种发酵上清液去除装置,通过新设纵向丝杆转动带动螺母座移动,螺母座通过弹性卡扣带动连接软管移动,继而对上清液的吸取高度进行调节,从而实现了上清液吸取高度的快速调节功能,大大提高了上清液的吸取效率,解决了原有上清液去除装置无法对上清洗液吸取位置进行调节,上清液吸取效果不佳,极易将菌体吸出,造成菌体浪费的问题。