[00130693]黄曲霉毒素M1免疫吸附剂的分子设计及在乳中选择性吸附机理

1、课题来源与背景： 课题来源黑龙江省自然科学基金面上项目;背景：国外针对AFM1的研究多以乳中污染度的调查、风险评估为主,而国内学者发表的论文多以AFM1的尖端检测方法的构建为主,随着对AFM1检测技术及风险评估水平的进一步发展,预防和降低乳中AFM1污染的基础性研究必将会引起重视。 2、研究目的与意义： 黄曲霉毒素M1因其主要存在于乳中,因此最初也叫“牛奶毒素”,是由de Iongh等发现后发表在1964年的Nature杂志上,随着研究的深入发现AFM1是AFB1在体内经细胞色素P450系列酶的作用下经羟基化所形成,一般认为AFB1的羟基代谢物是毒素的解毒形式,然而AFM1不能被看作是AFB1的解毒产物,有许多实验研究表明AFM1都具有细胞毒性和致癌性,是目前影响乳制品安全性的重要有害物之一。 本项目提出了采用高效体外选择性免疫吸附去除乳中AFM1的设想,即利用高特异性单克隆抗体和特殊载体材料制备高效专一的体外免疫吸附剂,通过免疫吸附降低乳中AFM1的残留,进而保障乳制品的安全性,为整个液体食品中有害物的免疫吸附去除研究提供共性技术,具有重要科学意义。 3、主要论点与论据： （1） 适合免疫吸附的抗AFM1单克隆抗体制备 首先,进一步完善项目组前期确立的HTS-ELISA高通量杂交瘤细胞筛选方法体系,探索适合免疫吸附用单克隆抗体的有效筛选和制备方法,分析免疫剂量、免疫动物品系、细胞融合方法、Trailing、无血清培养基驯化等因素对单克隆抗体品质的影响;其次,确立利用蛋白A/G纯化柱和膜浓缩系统直接从无血清细胞培养液中制备高纯度抗体的技术参数,确保制备的单克隆抗体具有良好的配体活性,同时构建和优化AFM1快速检测ELISA体系; （2） 载体材料配基的设计和筛选载体材料配基的特点是需要保障其能与抗体的Fc段结合而不与抗体的抗原决定簇反应,为此需要研究设计和筛选可优先与抗体Fc段反应的小分子功能配基基团。分析不同官能团的电子云分布及π-π电子对作用的分子间微观作用力,精细研究配基及抗体的分布密度,排列,间隔臂的长短,连接强度等对免疫吸附剂的抗原亲和性、特异性的影响; （3）免疫吸附剂的吸附动力学及吸附平衡特征免疫吸附剂的吸附性与乳液的状态密切相关,包括乳液的静态和动态、流动速度、压力、温度、AFM1浓度及扩散力等,精密分析吸附质的外扩散、内扩散、表面扩散及吸附的过程,依据吸附理论通过实验分析免疫吸附剂的吸附动力学及吸附平衡特征,揭示吸附剂的选择性吸附机理;在免疫吸附动力学和吸附平衡特征分析的基础上依据实验数据反馈探索载体配基设计的合理性,反复筛选适合免疫吸附的单克隆抗体,不断优化抗体偶联参数,解析单克隆抗体、载体、配基及其组合对免疫吸附乳中AFM1的吸附特性; 4、创见与创新： 1)该研究的创新思路在于提出了通过体外选择性识别吸附去除乳中的AFM1的方案,该方法具有无损鲜乳营养基础上特异性吸附去除AFM1的特点,通过该研究有望解决鲜乳中有害物难以直接去除的难题; 2)利用抗AFM1单克隆抗体恒定区Fc段的基团特点进行固定化配基结合作用的分子对接模拟及配基设计,确保免疫吸附剂中单克隆抗体的Fc段有序结合在载体配基基团上,保障单克隆抗体Fab段抗原决定簇的活性不受影响,有效提高免疫吸附剂的吸附性能; 3)本研究是在经典单克隆抗体技术的基础上,巧妙利用板间微孔的Trailing限制基于HTS-ELISA高效筛选体系筛选杂交瘤细胞,并利用无血清培养基制备不含牛血清的高纯度AFM1单克隆抗体,确保抗体的特异性、稳定性和安全性,同时选用无害合成高分子材料为载体固定化单克隆抗体,有望解决免疫吸附剂难以灭菌和贮藏的难题。 5、社会经济效益,存在的问题： （1）由于本研究研制的免疫吸附剂主要还处于实验室阶段,因此在提高吸附效能、工业化领域的应用等方面的研究还需要进一步开展; （2）在研究过程中载体材料的结构对抗体偶联后的效果具有影响,有更多的载体材料需要不断开发; （3）大容量液体中的吸附效果及改善方案还需要深入的研究。 6、历年获奖情况： 1)AFM1快速测定单克隆抗体的制造及其应用的研究 获2016年黑龙江省高校科学技术三等奖 第一参加者; 成果简介：该项目完善了HTS-ELISA高通量杂交瘤细胞筛选方法体系;确立了抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体制备方法;合成出各种有效结合黄曲霉毒素M1的载体材料、偶联抗体方法及免疫吸附性能;获得实用新型专利“牛奶中黄曲霉毒素M1吸附亲和柱检测装置”。本项目提出了采用高效体外选择性免疫吸附去除乳中AFM1的设想,即利用高特异性单克隆抗体和特殊载体材料制备高效专一的体外免疫吸附剂,通过免疫吸附降低乳中AFM1的残留,进而保障乳制品的安全性,为整个液体食品中有害物的免疫吸附去除研究提供共性技术,具有重要科学意义。