[00132478]基因转染方法促进骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为神经元样细胞

(1)任务来源 项目名称：转基因骨髓间质干细胞治疗脑外伤的研究;文件编号：粤科规划字[2009]155号;横向项目：βN GF 重组腺病毒高效表达载体系统转染 MSCs。 （2）应用领域和技术原理 β-NGF基因转染通过调节AKT、MAPK信号转导通路促进BMSCs分化成神经元细胞。为下一步BMSCs移植入颅脑外伤动物模型中奠定基础。为脑外伤的治疗探索新的更有效的方法。技术原理：（1） βN GF 重组腺病毒高效表达载体系统的构建;（2） βN GF 重组腺病毒生产及感染大鼠 MSCs 细胞;（3） MSCs 细胞体外定向分化模型的建立;（4） 大鼠脑外伤模型的建立;（5） 大鼠脑外伤模型进行 MSCs 移植,结合 RNA- PCR、免疫细胞化学及蛋白质免疫印迹等方法实现基因功能性及蛋白质表达筛查。 （3）性能指标 研究目标： ①利用转基因技术,以缺陷型腺病毒作为载体, 生成高效表达的βN GF 重组腺病毒载体系统;（已完成）②转染大鼠的 MSCs 细胞移植入大鼠脑外伤模型,明确 MSCs 在脑外伤的神经修复过程中所起的作用;（已完成）③通过研究转染与非转染的 MSCs 在大鼠脑外伤恢复过程中的区别,探讨转基因神经干细胞在宿主内表达外源性细胞因子的能力及对脑外伤大鼠神经功能恢复的影响;（已完成）④利用重组腺病毒载体系统建立神经修复相关基因功能研究的模型;（已完成）⑤研究转基因骨髓间质干细胞在体内微环境中分化为神经细胞的机制。（正在进行中）⑥研究转基因骨髓间质干细胞在体内分化为神经细胞后与其他神经元的突触联系,探讨MSCs修复受损神经的机制。（尚未完成） （4）与国内外同类技术比较 目前脑外伤治疗的方向越来越倾向于基因治疗,其中病毒作为载体约占了85%,因此重组病毒载体成为基因治疗的关键。本课题的最终目的是通过利用重组腺病毒载体携带外源性神经生长因子（βNGF）基因转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）,检测βNGF的表达及分泌,把转染后的BMSCs体外诱导分化为神经元样细胞,为下一步BMSCs移植入颅脑外伤动物模型中奠定基础。为脑外伤的治疗探索新的更有效的方法。 成果的创造性、先进性 经“科学技术部西南信息中心查新中心（国家一级科技查新咨询单位,报告编号：J201608017367）”机构查新后,总结出以下几点创新点： 1：利用βNGF重组缺陷复制型腺病毒,成功构建了重组腺病毒（pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-βNGF）。 2：采用重组腺病毒携带外源性小鼠神经生长因子（βNGF）基因转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）,检测转染后细胞的NGF的表达及分泌。 3：利用βNGF重组缺陷复制型腺病毒转染的BMSCs在体外诱导分化后所得的细胞,通过免疫组化、免疫荧光、western-blotting法检测βNGF的表达等方法加以鉴定,确认其为神经元样细胞。 4：证明：过度表达的βNGF通过调控AKT、MAPK通路促进骨髓间充质干细胞分化为神经元细胞。 “科学技术部西南信息中心查新中心”机构所检出的文献经过分析比较,得出结论如下： 涉及具备本项目所述技术特点的“利用基因转染方法促进骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为神经元样细胞”,所检索范围及时限内,除本项目外,国内未见相同文献报道。 （6）作用意义（直接经济效益和社会意义）。 综合证明,β-NGF基因转染通过调节AKT、MAPK信号转导通路促进BMSCs分化成神经元细胞。为下一步BMSCs移植入颅脑外伤动物模型中奠定基础。为脑外伤的治疗探索新的更有效的方法。 （7）推广应用前景与措施 应用前景： 1.βNGF 重组腺病毒载体系统建立神经修复相关基因功能研究的模型。 2.为 MSCs 治疗脑外伤提供理论依据。 3.为脑外伤的治疗探索新的更有效的方法。 4.为后续 MSCs 研究提供基础。 5.在脑外伤相关药物的研发中发挥重要作用。 措施：目前,创伤性脑损伤是造成永久性残疾的主要原因,严重影响了患病人群的生活及社会劳动能力。中枢神经系统障碍是由大脑特定区域的细胞损失造成的,如亨廷顿病、阿尔茨海默病等。本研究结果显示,在受伤的中枢神经系统,骨髓间充质干细胞的移植被证明能改善中风或脑外伤后的恢复。βNGF-骨髓间充质干细胞也被证明有分化为神经样细胞的能力,可以有效地防止神经元死亡引起各种症状的产生,大大地恢复患者的生活及社会劳动能力。但因研究生产的技术闪尚不成熟,以及该研究在临床治疗技术及治疗方案中处于刚起步的时期,所以要到达普及仍需经验及技术的积累。近年来,BMSCs引起公众的关注,在疾病的研究和治疗,有卓越的成就,对来的医疗及研究将起到一定的作用。