[00132631]糖尿病视网膜微血管病变的基础及临床研究

1．任务来源：　　1）湖南省优秀博士学位论文专项基金：《细胞外机制/基质金属蛋白酶与糖尿病视网膜病变》(1341710080000)　　2）湖南省科技计划项目：《Flt-1治疗糖尿病视网膜病变的研究》(05FJ3067)　　3）湖南省科技厅社会发展基金：《眼科疾病诊疗新技术研究》（04SK3034/3）　　4）湖南省自然科学基金：《Bax介导的视网膜毛细血管周细胞的稳定和破坏机制》（05jj30166） 《缺氧诱导因子-1在糖尿病视网膜病变中的作用机制》（06JJ3015）　　2．技术原理　　糖尿病视网膜微血管病变是目前发达国家致盲的主要原因，随着我国人口老龄化发展，其发病率逐年增加，极大地影响人们的工作和生活，为治疗所支付的费用也是巨大的，但由于对其发病机理的认识仍不十分明确，故目前也无理想的治疗方法。随着分子生物学理论和技术的迅速发展，对糖尿病视网膜微血管病变的研究也从病理、生理层面深入到细胞和分子水平。我们从2001年1月到2008年1月在上述省级科研基金课题的资助下，从基因、蛋白水平、凋亡调控、细胞增殖等角度系统研究了糖尿病视网膜微血管病变的细胞及分子机理，并观察了中草药对其的防治作用。　　3．性能指标　　1）本研究采用DNA末端转移酶介导的凋亡细胞原位检测技术、流式细胞技术观察了高糖、糖基化终产物作用下视网膜微血管周细胞凋亡的存在；并用酶联免疫吸附实验（ELISA）观察了周细胞凋亡调节基因、凋亡调节信号通路的变化以及相互关系；以及观察了中草药氨基胍、水飞蓟素对周细胞凋亡的抑制作用；　　2）采用非平衡法、硝酸还原酶法定量观测了糖基化终产物作用下周细胞分泌一氧化氮及内皮素-1的水平；　　3）采用琼脂糖凝胶电泳法观察了糖基化终产物作用下视网膜微血管周细胞内明胶酶的分泌；　　4）采用MTT法、透射电镜、细胞吸附移行试验、免疫组织化学、ELISA观察了缺氧条件下，视网膜微血管内皮细胞增殖、移行、血管内皮细胞生长因子（VEGF）变化及相互关系，缺氧诱导因子（HIF-α）的表达、以及兆科降纤酶、整合素抗体对内皮细胞增殖、移行的影响；　　5）采用ELISA、Western Blot、免疫组织化学等方法观察了糖尿病动物视网膜病变中VEGF，HIF-α、细胞凋亡等的变化，以及HIF-α反义寡核苷酸、中药银杏叶提取物对其防治作用。　　4.成果的创造性、先进性　　第一，我们在国内外系统论证了糖尿病视网膜微血管病变中视网膜微血管周细胞的消亡是通过凋亡进行的，较早发现周细胞的凋亡与细胞内过氧化氢酶、超氧化物岐化酶活性下降，抗氧化代谢及caspase-3活性增加、凋亡调节基因Bcl-2/Bax比率下降有关，并在国内外首次报道周细胞的凋亡率由Bcl-2/Bax的比率决定。　　第二，在国内外首次报道糖基化终产物作用下，周细胞分泌明胶酶活性的下降是导致糖尿病微血管病变中基底膜增厚的主要原因，而周细胞内内皮素含量的增加、一氧化氮含量的下降是血管收缩闭塞的另一重要原因。　　第三，在国内首先报道缺氧能导致视网膜微血管内皮细胞表达整合素αvβ3、HIF-α及VEGF增加，而内皮细胞的增殖、移行与整合素、VEGF，HIF-α活性增加有关。　　第四，在国内外首先报道兆科降纤酶、整合素抗体、HIF-α反义寡核苷酸能显著抑制视网膜微血管内皮细胞对细胞外基质的粘附、移行和增殖。　　第五，在国内外首先报道氨基胍、水飞蓟素能有效保护糖基化终产物诱导的视网膜微血管周细胞的凋亡；　　第六，我们进行了动物实验，并发现糖尿病视网膜微血管病变中存在视网膜细胞凋亡、VEGF，HIF-α活性增加，这与体外实验结果一致，而中药银杏叶提取物能明显抑制糖尿病视网膜微血管病变的发生。　　第七，我们首先报道了银杏叶提取物抑制糖尿病视网膜微血管病变的发生与抑制VEGF的表达有关。　　4．作用意义　　这些研究从分子水平上揭示了糖尿病视网膜微血管病变的发病机理，填补了有关糖尿病视网膜微血管病变中周细胞凋亡、内皮细胞增殖、基底膜增厚发病机理方面的相关空白，为本病的防治打下了良好的基础，在此基础上开发出新的治疗药物，又将为社会产生巨大的经济效益。本研究通过细胞及动物实验阐述了中草药在防治糖尿病视网膜微血管病变中的作用，为深入研究防治糖尿病视网膜微血管病变的中药提供了新的思路和途径，有利于充分开发中药，提高中药在世界医药中的地位。　　本项目研究内容已在国内外杂志发表学术论文30篇，其中SCI论文1篇，中华牌杂志7篇。其余为核心期刊。论文均在全国或省各种眼科会议上进行过交流。其中《糖基化终产物促糖尿病视网膜病变细胞及分子机制》获湖南省优秀博士论文称号；《糖基化终产物诱导牛视网膜毛细血管周细胞凋亡及凋亡调节基因的表达》和《兆科降纤酶、抗αvβ3整合素抗体对牛视网膜血管内皮细胞粘附，移行的影响》两篇文章均获湖南省医学会优秀论文二等奖。论文发表后有多位学者在多种不同杂志中引用，并被多种医学数据库SCI、MEDLINE、CSCD等收录。国内外多个学者已利用本项目的研究成果进行抗糖尿病视网膜微血管病变的临床治疗研究，而利用抗氧化药物防治糖尿病视网膜微血管病变已被临床医生所广泛接受，中草药银杏叶提取物也已用于临床，并已在各地推广，应用前景广泛。