[00132925]当归红芪超滤膜对卵巢颗粒细胞增殖及bcl-2/bax凋亡蛋白表达的影响

1、课题来源以及背景：本课题来自甘肃省科技厅自然科学基金项目,项目划拨经费3万元。项目编号：148RJZA072。 2、研究背景：黄芪和当归按照5：1的比例组方而成的当归补血汤作为经典方药临床用于补血养血,尤其针对卵巢功能衰退引起的月经量过少、闭经的患者。卵巢颗粒细胞是卵泡的营养细胞,其开始程序性死亡是卵泡闭锁的标志。通过前期的临床和大鼠卵巢颗粒细胞增殖实验结果表明,当归补血汤能明显改善卵巢功能衰退症患者自觉症状,促进颗粒细胞增殖,改善卵泡发育的营养,提高血清E2和P水平;改善卵巢的功能。本研究用超滤膜分离技术提取当归黄芪超滤膜,通过细胞生物学实验技术,以原代培养的大鼠卵巢颗粒细胞为基础,从细胞水平上探讨当归黄芪超滤膜提取物对大鼠卵巢颗粒细胞增值作用,明确当归补血汤改善卵巢功能的作用机制。观察当归黄芪超滤膜提取物bcl-2/bax凋亡蛋白的表达,在促进卵泡发育,恢复卵巢的功能,降低POF的发病率中的作用,为临床应用提供理论依据。 3、技术原理及性能指标： 1)当归红芪超滤膜提取物制备。 2)大鼠卵巢颗粒细胞的提取,倒置显微镜、直接和间接荧光显微镜下观察细胞核鉴定颗粒细胞。 3)用MTS方法监测当归红芪超滤膜提取物对大鼠卵巢颗粒细胞24h、48h和72h增殖情况。 4)选取最佳作用浓度和作用时间段。 5)当归红芪超滤膜提取物对性激素水平的影响,监测E2和P的含量。 6)用Western-Blot法监测当归红芪超滤膜提取物对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡蛋白bcl-2和bax蛋白表达的影响。 4、解决技术问题： 1)从补气养血角度研究中医药对女性H-P-O-A的调节作用,初步展示了中医药在防治女性卵巢功能衰退中的优势。 2)更充分明确颗粒细胞提取和培养所需要的环境以及细胞培养的关键步骤。 3)此实验用Western-Blot法监测主要凋亡蛋白（bcl-2和bax）,同时本实验也做了部分关于卵泡发育有关的Smad4、细胞周期蛋白cylinA,进一步明确当归补血汤对卵巢功能影响的互联方式及相关因素。 4)从分子水平和基因水平研究中药对卵泡发育影响的关键部位以及中药促进作用的作用靶点。 5、应用情况及存在问题： 1)当归红芪超滤膜提取物药物利用效率没有进一步明确,动物的利用率和人之间有一定差异。 2)本实验主要初步探讨了当归红芪超滤膜提取物促进颗粒细胞增殖,颗粒细胞是卵泡发育的营养细胞,但是卵泡发育和颗粒细胞之间也是通过相互联系、相互影响,单纯颗粒细胞体外增殖并不一定就说明此药物一定对卵泡的发育有促进作用,卵泡的生长发育受卵泡雌激素和雌激素以及相关影子的影响,所以有待于以后能将卵巢组织体外培养,研究药物对其作用的机制。 3)本实验采用单一颗粒细胞体外培养,颗粒细胞的生长发育以及对卵泡发育的影响,以后通过颗粒细胞和卵巢组织共同培养,研究其作用机制更有临床意义。 4)动物实验和人体细胞之间存在差异,以后有可能的条件下和生殖中心合作,在超促排卵下提取人体颗粒细胞进行实验,更有临床意义。同时由于经费问题,本实验所选实验样本数量少,观察时间短,也影响对其疗效的进一步判断。 6、历年获奖情况：无