[00132942]龙葵总碱促进转染带3蛋白跨膜域K562细胞凋亡作用机制研究

该项目主要观察了龙葵碱诱导HepG2细胞凋亡作用及作用机制。并深入探讨了NAT酶与细胞凋亡之间的关系。　　完成了以下三个方面的工作：　　(1)龙葵碱诱导HepG2人肝癌细胞凋亡作用及通路研究。　　(2)NAT酶与细胞凋亡的关系。　　(3)龙葵碱对HepG2细胞NAT酶活性、mRNA表达及作用的活性亚基位点的影响。　　实验中采用了激光共聚焦扫描显微术(confocal)、流式细胞术、RT-PCR、Western blot、HPLC等先进的研究手段。研究结果表明：　　(1)通过MTT法筛选发现龙葵碱对HepG2细胞有较强的细胞毒作用，IC50为14.47μg/mL。采用AO/EB双染HepG2细胞，confocal观察龙葵碱对HepG2细胞形态的影响，发现龙葵碱使HepG2细胞出现凋亡小体等典型的细胞凋亡形态。采用PI单染，流式细胞术观察发现5个不同剂量龙葵碱诱导HepG2细胞凋亡率分别为6.0%、14.4%、17.3%、18.9%、32.2%。表明龙葵碱能够诱导HepG2细胞凋亡。采用confocal、Western blot等技术进一步研究龙葵碱诱导细胞凋亡的机制表明龙葵碱能够抑制Bcl-2蛋白的表达，促进Cyt.C的释放，降低细胞膜电位，开放PT通道升高细胞内Ca^(2+)浓度，增加caspase-3蛋白表达，激活caspase蛋白家族，诱导细胞凋亡的发生。　　(2)发现NAT酶是一种细胞凋亡抑制酶。测定喜树碱诱导凋亡的细胞的NAT酶活性，发现NAT酶活性下降；抑制HepG2细胞NAT酶活性后，能够促进喜树碱诱导HepG2细胞凋亡。　　(3)采用AcCoA-HPLC法，以2-AF为底物，HPLC测定NAT酶的活性，发现龙葵碱是一种NAT酶非竞争性抑制剂，进一步研究发现龙葵碱通过失活NAT酶半胱氨酸亚基-SH键而抑制NAT酶活性，进而促进细胞凋亡的发生。 　　结论：　　（一）龙葵碱能够诱导HepG2细胞凋亡，诱导凋亡的通路为：龙葵碱作用的始动部位为Bcl-2蛋白，首先抑制Bcl-2蛋白的表达，进而一方面促进Cyt.C的释放，另一方面开放PT通道。Cyt.C的释放能够引起细胞凋亡的发生，而PT通道的开放会升高Ca^(2+)，Ca^(2+)升高能够启动细胞凋亡，同时Ca^(2+)升高能够增加Cyt.C向胞浆的释放，激活caspase蛋白家族，诱导细胞凋亡的发生。此为龙葵碱诱导HepG2细胞凋亡作用机理之一。　　（二）NAT酶是一种细胞凋亡抑制剂，龙葵碱是NAT酶非竞争性抑制剂，通过降低NAT mRNA表达和失活NAT酶半胱氨酸亚基-SH键而抑制NAT酶活性而诱导Hep2细胞凋亡。此为龙葵碱诱导HepG2细胞凋亡作用机理之二。　　（三）综上得出NAT酶是线粒体凋亡通路中的一部分，并且与Bcl-2蛋白有着一定的关系。