[00133544]重组多肽蛋白药物高效生产关键技术

(1)任务来源 本关键技术是基于西藏诺迪康药业股份有限公司、成都芝田生物工程有限公司、 西华师范大学、四川恒星生物医药有限公司四方共建的产学研开发平台而形成的,研究任务来源于公司自选。 （2）应用领域和技术原理 本项目技术应用于医药领域,主要应用于具有药用价值的的低分子量多肽,对宿主菌株毒性较大的蛋白,稳定性较差的蛋白和容易被宿主蛋白酶降解的蛋白类药物的融合表达及规模化工业生产。 技术原理：小分子多肽药物是由20-100个氨基酸组成的多肽,如用于急性心衰治疗的人脑利钠肽（rhBNP）,为32个氨基酸残基组成的具有内环的多肽;用于II型糖尿病治疗的胰高血糖素样肽-1受体激动剂（Exendin-4）,由39个氨基酸残基组成的。这类多肽由于其分子量较小,无法使用常规的基因重组方法进行构建、表达、分离纯化。目前国内外针对该类多肽多采用化学合成方法,但存在生产工艺复杂、反应难控制、生产成本高、有环境污染（大量使用有机溶剂）等弊端。另外还有一些蛋白质药物,如人角质细胞生长因子（KGF-1）,这类蛋白对大肠杆菌等常用宿主细菌具有很强毒性,无法在宿主内高效表达,据国内外文献报道rhKGF-1蛋白的表达量仅为全菌蛋白的1%-2%,这使得其按常规原核表达技术来实现规模化生产的可能性几乎为零。 本项目从多肽蛋白类药物基因结构、蛋白结构与功能关系出发,设计一系列特异性高效表达的融合表达载体如pGEX 、pDTa等,并在特异表达的蛋白前加入融合伴侣,如GST、DAB,构建了高效表达目标融合蛋白的宿主菌株;以包涵体形式表达的融合蛋白,则利用独特的复性技术提高其复性得率;所有的融合蛋白,我们均利用特异性酶切技术如高纯度的Enterkinase、Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等,切掉融合伴侣,从而获得与天然蛋白结构与功能完全一致的目标多肽或蛋白质,实现有价值的目标小分子多肽和低表达、高毒性蛋白质的规模化工业生产,使之应用于临床。 1. 高效融合表达基因工程菌的构建 本关键技术从低表达的小分子多肽和蛋白的基因结构、蛋白结构与功能关系出发,创造性的运用蛋白质融合表达技术,设计具有对目的蛋白的表达和纯化效率具有显著提高的融合蛋白,从根本上提高低表达的小分子多肽和有毒性的蛋白表达效率。使其可用作工业化规模生产。 针对仅有20-100氨基酸的难表达且不易定量检测的小分子多肽,设计并构建了pTDa作为融合表达载体,该载体的转录启动能力比LacUV5启动子强5倍,从而为小分子多肽药物如rhBNP等融合蛋白的高效表达提供了前提条件。同时还创造性地在目的基因末端加上融合伴侣如硫氧还蛋白（Thioredoxin）,硫氧还蛋白融合伴侣本身的分子量不大,因而间接提高了小分子目的多肽在整个表达中所占的比例,更为重要的是其本身是质子供体,在因融合蛋白高效表达而形成包涵体的情况下,在包涵体的复性过程中,融合伴侣能够协助融合蛋白正常折叠,从而将极大的提高复性效率,使工艺得到简化。 另外,一些使用常规基因工程手段表达量极低的小分子多肽,目前主要通过化学合成的手段大规模生产,由于其化学合成过程中需要使用有机溶剂,极易造成环境和安全性问题。针对此种多肽,本项目创造性的设计了pET-DsbA改构体。该载体表达的DsbA融合蛋白是具有协助二硫键形成的重要分子内伴侣。本项目通过对DsbA做突变处理,去掉其信号肽基因,同时将其氧化还原功能相关的两个半胱氨酸（Cys）突变成丝氨酸（Ser）,从而实现目标多肽的可溶性表达,避免复杂的复性工艺。 对于一些人源化蛋白,如重组人角质细胞生长因子（rhKGF-1）,其本身对宿主细菌具有较大毒性,因此表达量仅有1%-2%,无法实现规模化生产。本项目采用pET-GST载体表达系统。其中pET系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白功能最强大的系统,较为适于表达毒性蛋白,可有效减少因目的蛋白的本底表达对宿主细胞生长和质粒稳定性的影响,有利于提高目的蛋白的表达量。同时我们还添加了分子伴侣GST作为表达rhKGF-1的融合标签。首先GST标签可解决非融合表达时,蛋白的mRNA因在翻译起始阶段形成茎环结构而降低表达量的问题;其次可利用GST增加蛋白表达和促进蛋白正确折叠的特性,提高稳定型蛋白改构体的表达量和溶解性,有利于进行大规模的发酵生产;第三GST的空间屏蔽作用会遮蔽rhKGF-1发挥毒性作用的活性位点,减弱其“毒蛋白”作用。最终本项目获得rhKGF-1融合蛋白改构体表达量达20%以上。从根本上该类蛋白的稳定、高效表达,顺利实现规模化生产。 2. 融合蛋白的特异性切割 在融合蛋白表达体构建中,我们创造性的在融合蛋白基因上加入特异性的酶切位点,如高纯度的凝血酶、或者Enterkinase即EK酶等酶切位点,利用特异性酶切技术,切掉融合伴侣,从得到与天然结构完全一致的目标多肽或蛋白质。 3. 高稳定性目标蛋白的分离纯化 重组蛋白都要经过多种不同层析介质的纯化才能获得高纯度的目的蛋白。本项目构建带有融合标签的融合蛋白,这使其纯化方法变得简单易行,通常只需1-2种亲和层析介质就可达到纯化目的蛋白的目的。如融合蛋白GST-目标蛋白改构体在N端带有His融合标签,使用组氨酸亲和胶（Ni-NTA Resin）,只需一步亲和层析即可获得纯化的目的蛋白,纯化工艺更加简便快捷,可有效降低生产成本。 （3）性能指标 本公司首先从rhBNP、Exendin-4、rhKGF-1、rhPTH（1-34）等现有技术表达量低,无法通过常规技术实现规模化大生产的小分子多肽及蛋白出发,创造性的运用融合蛋白表达技术,通过构建不同的融合蛋白形成新型改构体,从而获得高效表达的工程菌株;利用特异性酶切技术实现融合伴侣与目的蛋白的分离,获得了与天然结构完全一致的目标蛋白,并实现了规模化生产的应用,使得这四个品种成为了具有自主知识产权的上市及即将上市的产品,为小分子多肽及毒性较大的蛋白类药物规模化生产提供的新的思路,有效的促进了我区生物技术药物的进步,也缩短了我国生物技术药物规模化生产方面与国外的差距,极大的造福了广大患者。现将对采用本项目融合表达关键技术获得的产品BNP、Exendin4、KGF-1及PTH性能指标作如下阐述： 1. 重组人脑利钠肽（rhBNP） rhBNP为小分子多肽药物,分子量仅3464 Da,由于分子量较小,用常规基因工程技术难以表达,而利用本项目融合蛋白表达技术获得的rhBNP纯品得率300mg/L发酵液;半成品纯度大于95%（RP—HPLC分析）以上,N-末端测定、分子量质谱测定、等电点测定、氨基酸组成测定、生物活性测定与人体天然BNP完全一致,rhBNP成品活性、安全性、热源、稳定性、无菌检测完全合格。 2005年获得国家新药证书和生产批件,2007年还被国家发改委认定为“国家高技术产业化示范工程”,目前年销售额达1.2亿元左右。 2. 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4） rExendin-4为39个氨基酸残基组成,据国内外文献报道其无法表达,现有上市品种为化学合成,而本项目产品rExendin-4纯品得率为每升发酵液20mg,半成品纯度大于95%（RP-HPLC分析）以上,等电点测定、氨基酸组成测定、生物学活性测定等理化性质和生物学特性与文献报道完全一致。rExendin-4成品活性、安全性、热源、稳定性、无菌检测完全合格,其药理学各项指标与理论值完全一致,且与化学合成产品具有相同的理化性质和生物学活性。该产品的临床前研究和临床试验均获得了十一五国家重大新药创制重大专项资助,现已获得国家一类新药临床批件,并已成功转让给国内龙头制药企业—石药集团。 3. 重组人角质细胞生长因子-1（rhKGF-1） 由于KGF-1对宿主细菌毒性较大,国内外文献报道表达均为1-2%的表达,根本无法实现工业化生产。本项目通过融合表达技术,rhKGF-1表达效率可达全菌蛋白的20%左右,产量提高10多倍,分离得到的纯品可达每升发酵液50mg。其理化性质、生物学活性与人体天然KGF一致。该产品成为十一五国家重大新药创制重大专项资助品种,现已经完成临床前研究的全部资料,率先获得临床受理通知书,正在等待SFDA颁发临床受理批件。 4. 重组人甲状旁腺素（1-34）[rhPTH（（1-34））] rhPTH（1-34）是目前国内开发的首家唯一一种开发目前唯一促进骨形成的药物,它与人体内天然的人甲状旁腺素（1-84）的C--端的第1-34个氨基酸具有相同的氨基酸序列,并且二者具有相同的生物学活性和生理、药理学特征,是采用基因重组技术获得的小分子多肽药物。经连续三批中试生产结果表明,本项目各批次产品基本一致,完全达到了本项目检定规程所规定的各项指标,根据《中国新生物制品检定规程》要求,我们生产的hPTH半成品纯度大于95％（RP—HPLC分析）以上,N—末端测定、分子量质谱测定、等电点测定、氨基酸组成测定与人体内自然分泌的PTH（Parathyroid Hormone）的N-端部分完全一致,rhPTH成品活性、安全性、热源、稳定性、无菌检测完全合格。结果表明其生物活性测定及药理学各项指标与国外产品文献报道结果基本一致。目前,本产品已获得SFDA颁发的临床批件（批件号：2003L01454）,并进入II期临床研究阶段。 （4）与国外同类技术比较 融合表达使外源基因连接到融合蛋白的C-端,不必另外设计SD序列,同时N-端的存在使得外源基因的表达较容易;同时因为外源基因的表达产物常被宿主细胞的蛋白酶降解,当外源基因与宿主本身蛋白的部分序列构成融合基因的形式表达时,会减低宿主细胞对产物的降解。因此国内外学者常将融合蛋白技术用于蛋白的表达方面。 但国内外的研究仅停留在对单一品种的研究,且形成融合蛋白表达后多形成包涵体,需要通过变性、复性、纯化等复杂手段才能获得目的蛋白。就目前国内外的研究情况来看,目的蛋白的复性至今没有通用的有效方法,使得利用融合蛋白表达技术无法推广应用到不同类型的目的蛋白。无法解决基因工程药物表达量低,目的蛋白稳定性差、纯品得率低、生产成本高以及工业化大生产困难等问题,严重的制约了当今基因工程药物的发展。 本项目研发团队通过构建特异系列表达载体,筛选一系列具有不同功能的融合蛋白标签,能最大限度的满足不同种类的目的蛋白如分子量较低的多肽类,对宿主菌株毒性较大的蛋白类,稳定性较差的蛋白类,容易被宿主蛋白酶降的蛋白类等目的蛋白的融合表达,获得高表达菌株,然后通过设计特异酶切技术,获得具有生物活性、折叠正确的可溶性目的蛋白;同时简化纯化步骤,获得产率和纯度较高的目的蛋白,形成了较为成熟的技术平台和关键技术,能被广泛的用于开发不同种类,特别是小分子及对宿主具有显著毒性和低表达重组多肽及蛋白类药物。 本研究团队应用融合表达技术成功的的研制出rhBNP、rhKGF-1 、rhExendin-4等系列产品,与国内外同类产品相比也具有明显的优势,具体如下： 一、重组人脑利钠肽（rhBNP） 1. 创新融合表达：与硫氧还蛋白融合表达,融合伴侣促进BNP环状活性结构自动回复。 2. 特异性定点切割：将rhBNP与融合伴侣完整,准确切割,获得与人体BNP完全一致的结构和功能。 3. 高载量低压反相纯化技术：创造性采用低压反相层析技术,纯化效率高、载量高;为小肽药物的制备提供新的方法和手段。 4. 本产品具有自主知识产权,目前该产品唯一竞争品种为美国强生的Natrecor,本产品与Natrecor先进性对比如下： A 生产方式：本品为基因重组药物,而Natrecor最初为化学合成,之后改为基因重组。 B 理化性质、生物学活性：与Natrecor完全一致。 C售价：本品为人民币1480元/支,N