[00133858]腈水合酶交联酶聚集体-氧化硅催化剂的制备与催化性能

1.课题任务来源：天津市应用基础与及前沿技术研究计划（自然科学基金一般项目）（编号：13JCYBJC18500） 2.研究的目的和意义 腈水合酶是一种可以将腈类物质转化为酰胺类物质的酶,在其催化作用下,丙烯腈可以转化为丙烯酰胺,3-氰基吡啶可以转化为烟酰胺。酰胺类物质在有机合成、医药、农药等方面有着十分重要的应用。为提高该酶的稳定性和重复使用性,对其进行了固定化。交联酶聚集体技术是一种操作简单、成本低廉、应用广泛的无载体固定化酶技术。本项目采用大分子交联剂葡聚糖醛代替戊二醛制备腈水合酶交联酶聚集体,在此基础上,将交联酶聚集体技术同球化酶技术结合,能使固定化酶具有规则的、可控性好的形貌,也能改善操作过程中难分散的问题。 3.技术原理及性能指标 本课题开展了一下几方面的工作： （1）利用交联酶聚集体技术,采用葡聚糖醛作为交联剂,对腈水合酶进行固定化。优化了沉淀剂种类、沉淀剂用量、交联剂用量和交联时间等固定化条件,确定其最优条件为：在4 oC条件下,1体积的酶加入2体积的饱和硫酸铵溶液沉淀0.5 h,再加入终浓度为2.5 mg/mL的葡聚糖醛交联2 h,获得腈水合酶交联酶聚集体,酶活回收率为49.63%。考察了酶的稳定性,与游离酶相比,固定化酶有更好的pH、热和储藏稳定性、对高浓度底物的耐受性。在重复使用10次后,仍能保留初始酶活的85.23%。通过测定动力学常数,得到交联酶聚集体和游离酶的Km值分别为2.068、1.596 mmol/L,证明腈水合酶交联酶聚集体对底物的亲和性没有太大改变。 （2）利用球化酶技术制备了蛋清蛋白微球,并用葡聚糖醛将腈水合酶交联在蛋白球外部,得到球化腈水合酶交联酶聚集体。其优化的制备条件为：在4 oC,终浓度为3.9 mg/mL的葡聚糖醛加入到0.1 g球化蛋白中,活化反应2 h,洗涤去除多余的交联剂,沉淀中加入等体积的酶液及饱和硫酸铵溶液交联反应3 h,制得球化腈水合酶交联酶聚集体,酶活回收率超过50%。该球化酶的粒径在8-20 μm之间。与游离酶相比,球化腈水合酶交联酶聚集体对温度、pH的稳定性、储藏稳定性及对高浓度底物的耐受性有了一定的提高,且有较好的重复使用性,在使用10次后,还能保持初始酶活的85.07%。通过测试动力学常数,得到交联酶聚集体和游离酶Km值分别为1.958和1.596 mmol/L。结果表明,腈水合酶经过固定化后,对底物的亲和性并没有发生太大的改变。 （3）利用仿生硅化技术制备了固定化腈水合酶交联酶聚集体-氧化硅（NHase-CLEAs@SiO2）杂化生物催化剂。以正硅酸甲酯为前驱体,聚二甲基二烯丙基氯化铵为催化剂,葡聚糖醛为交联剂进行交联,温和快速地实现腈水合酶交联酶聚集体的包埋。NHase-CLEAs@SiO2的颗粒直径约为100 nm,酶活回收率为26.7%。考察了游离酶与NHase-CLEAs@SiO2的热稳定性、pH稳定性、操作稳定性以及储藏稳定性。结果表明,与游离酶相比,NHase-CLEAs@SiO2的稳定性有了明显的提高。同时,NHase CLEAs@SiO2显示了良好的重复使用性能,在重复使用10次后,仍能保留初始酶活的86.56%。 （4）制备的三种固定化酶应用于催化丙烯腈生成丙烯酰胺的反应中。腈水合酶CLEAs和球化腈水合酶CLEAs为催化剂时,底物浓度为50 mmol/L时,1.6 mg/mL的酶催化效率较高,在pH 7.0,30 oC下固定化酶能稳定的催化反应。以Nhase-CLEAs@SiO2为催化剂时优化的制备条件为反应温度40 oC,pH 7.0,腈水合酶活性4.36 U。 4.取得的成果：共发表和录用标注基金号论文9篇,全部被SCI收录;申请中国发明专利2项,其中1项已获授权。 5.本课题的创新点 ①利用CLEAs与乳化技术结合制备了球形腈水合酶CLEAs,实现了球形CLEAs微粒的可控制备; ②将CLEAs与仿生硅化过程相结合,制备了CLEAs-氧化硅杂化生物催化剂,提高了CLEAs固定化酶的机械强度和稳定性。 6.本课题存在的问题 本项目成功制备了性能较好的固定化腈水合酶,并实现了丙烯酰胺的高效制备,该方法具有通用性,可用于如漆酶、脂肪酶、蛋白酶等多种酶类的固定化过程,还可为多酶体系CLEAs-无机介质杂化生物催化剂的制备奠定基础。但仍有一些不足之处：球化酶虽然有一定的可控性和比较规则的形貌,但是项目采用的方法制备球化酶将腈水合酶暴露在载体外部,虽然有利于传质,但还应想办法进一步提高固定化酶的稳定性。因此,通过新型固定化酶的设计以及操作条件的改善开发更有效的固定化形式,促进目标产物丙烯酰胺的收率进一步提高是下一步主要研究工作方向。