[00134253]肝脏再生的相关分子机制研究

人和动物肝脏都具有极强的调节自身生长发育和体积大小的能力。肝细胞在正常情况下很少分裂,但在肝损伤如外科切除、化学性或病毒性损伤时会迅速表现出强大的增殖能力和调控能力,并根据肝脏和体重比例达到最适的肝脏体积。但其中的分子机制认识还很少,尤其对肝脏再生的适时终止、肝脏组织重构、肝脏体积与体重的精确比例调控等参与的信号分子和调控网络基本不清楚。因此,开展肝再生相关分子机制研究,不仅有助于阐明肝再生分子机制和完善对肝再生的认识;同时,将更有助于对肝脏肿瘤发生和发展机制的认识,并有可能为寻找肝肿瘤和其它肝病治疗的靶点提供新思路。本项目在国家自然科学基金和上海市科委基金等的资助下,利用一系列新技术（如蛋白质组学、代谢组学、芯片技术、RNA干扰、microRNA调控功能等）,在细胞水平和动物模型上对大鼠肝再生分子机制进行了较深入研究和探讨。 主要研究发现和论点： 1.肝脏再生过程中细胞凋亡变化规律及分子机制：利用大鼠70%肝切模型研究发现caspase-3在肝再生早期的氧化应激阶段和晚期终止阶段的活性明显升高,其激活通路主要是线粒体介导的内源性途径,并且发现在肝再生过程中线粒体功能、mPT（线粒体膜通透性转换）和凋亡蛋白酶活性三者密切相关,提出了“肝再生－mPT－线粒体蛋白释放”机制参与肝再生过程中的细胞增殖与凋亡的假设;免疫抑制剂CsA可特异性抑制肝再生过程中mPT和细胞凋亡。这为肝脏移植和各种肝炎损伤功能恢复,以及肝肿瘤治理的候选干预靶点提供了重要实验依据。首次建立了肝脏再生早期线粒体蛋白质组的差异蛋白谱,揭示肝再生早期线粒体蛋白Prohibitin核转移与mPT关系。研究发现不依赖p53的抗凋亡蛋白PUMA表达下调促进肝再生早期细胞增殖和抑制细胞凋亡,并且发现在肝癌和肝炎中PUMA表达升高可能引起凋亡调节通路的紊乱。研究表明GSK-3β可以通过调节NF-κB表达来影响肝再生,后者通过激活早期反应基因-2（IER-2）参与肝再生启动。 2.肝脏再生过程中MicroRNAs表达谱及作用机制： miRNA芯片筛选显著肝脏再生早期4个miRNAs上调和3个miRNAs下调;肝脏再生早期再生后期8个miRNAs上调和3个miRNAs下调,其中正性作用miRNAs在肝再生早期上调而后期下调,负性作用miRNAs则相反;miR-34a在肝再生后期表达显著升高并通过抑制靶基因INHBB和c-met的表达促进肝再生终止,而P53与miR-34a启动子序列PBS1位点结合促进miR-34a表达;在肝再生晚期表达显著下调的miR-23b而激活TGF-β1/Samd3通路参与肝再生的终止。肝再生早期DLK1-GTL2印记域内的miRNA簇（miR-376b、-494和-127）有共同的调控和变化趋势,其中负性作用的miR-127肝再生早期显著下调,对其靶分子（Bcl6、Sept7和Setd8）的沉默作用也下降,从而有助于肝细胞增殖和抑制凋亡。miR-127下调与其启动子区CpG岛甲基化水平有关。 3.多组学技术结合进行肝再生研究：基因芯片揭示427差异基因参与肝再生,在肝脏再生早期和后期显示不同的表达;在功能上表明肝再生早期高表达基因主要涉及应激、细胞增殖和抗凋亡,肝再生后期高表达基因主要参与脂类代谢。蛋白质组学显示肝再生早期差异蛋白质最多,主要与细胞增殖和能量代谢项;肝再生后期有5个蛋白质分子上调,3个下调,其中上调的脂肪酸结合蛋白质（E-FABP）参与过氧化物酶体激活因子受体（PPAR）通路,同时代谢组学数据显示肝再生后期脂类代谢增强。这表明脂代谢增强和PPAR通路激活与肝脏再生终止相关。 其它利用蛋白质组学技术筛选到了小鼠肝脏耐热蛋白谱,包括谷胱甘肽过氧化物酶、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶和regucalcin;成功地克隆和表达了人肝脏再生增强因子（hALR）并进行了中试研究。 创见与创新： 1.建立肝脏在终止阶段11个miRNAs显著差异表达谱,肝肝再生组织验证表明：正性作用miRNAs早期上调而后期下调,负性作用则相反。其中主要上调的miR-34a通过沉默INHBB和Met等靶分子抑制肝细胞增殖和促进凋亡而发挥重要作用,并证明P53通过miR-34a基因启动子序列PBS1位点结合促进miR-34a表达;主要下调的miR-23b通过沉默smad3而抑制TGF-B信号通路,同时发现TGF-B通路可抑制miR-23b表达,因此肝再生后期miR-23b下调有助于肝再生终止。 2.不依赖于p53的PUMA表达下调对肝再生进程具有重要意义;同时发现在肝癌和肝炎中PUMA表达改变引起凋亡调节通路的紊乱与疾病发生有关。 3.发现NF-κB通路的激活参与肝再生的启动。 4.系统研究了线粒体在大鼠肝脏再生中的作用,获得了一些新发现： （1）线粒体氧化磷酸化功能在大鼠肝再生过程中表现双峰形改变。 （2）线粒体通透性转换（mPT）变化规律也为双峰型改变一致,揭示mPT与线粒体功能改变有关;同时发现mPT变化伴有线粒体内蛋白质分子释放入胞质,线粒体蛋白质释放峰为PH后24h,这提示线粒体结构功能变化与肝脏再生启动和增殖有关。 （3）线粒体蛋白质组学揭示：大鼠肝脏线粒体蛋白具有碱性端密集的现象,肝再生早期的线粒体差异蛋白以下调居多,并与糖代谢﹑脂代谢﹑呼吸链、氧化磷酸化、生物转化等代谢途径有关,这与此时线粒体功能下降相关。线粒体差异蛋白下调可能与线粒体mPT-蛋白质释放有关。这进一步提示线粒体可能是肝再生过程中一个重要调节点。 （4）首次证实了Prohibitin 主要分布于大鼠肝细胞线粒体中;Prohibitin 参与了肝再生过程中线粒体的重建,具有维持线粒体膜电位的作用,与肝再生过程中线粒体的稳定和功能相关;Prohibitin 参与了再生过程中肝细胞增殖与凋亡的调节。 （5）免疫抑制剂CsA可特异性抑制肝再生过程中mPT和细胞凋亡。这为肝脏移植和各种肝炎损伤功能恢复,以及肝肿瘤治理的重要候选干预靶点提供了重要实验依据。 5.揭示了肝脏再生过程中细胞凋亡呈现双峰型,与线粒体mPT变化规律一致,基本证明线粒体凋亡途径参与了肝脏再生过程中的细胞凋亡。 总之,本项目围绕肝再生启动和终止的相关分子机制进行较系统研究,研究结果丰富和拓展了对肝脏再生机制的认识,同时对临床肝功能衰竭和肝癌的防治具有重要指导意义。研究成果总体处于国际先进水平,发表学术论文26篇,其中sci论文8篇,最高影响因子为9.334分,总计37.75分。发明专利1项,培养博士研究生10名,硕士研究生30名。