[00134371]高效种猪体细胞克隆扩繁技术研究与应用示范

1、本课题来源与背景：本课题来源于广东省科技计划项目。本课题背景：猪克隆技术在复制扩繁优秀种猪、保护珍稀猪种、制备基因修饰猪用于猪育种或生物医药领域等方面都具有重要的应用价值。但目前猪克隆技术的效率很低,主要表现在猪克隆胚胎发育至出生的效率只有约1%。如此低的效率限制了猪克隆技术的应用和发展。近年在小鼠克隆的研究中发现来源于供体细胞的组蛋白H3K9me3修饰是导致小鼠克隆胚胎发育停滞的主要障碍,通过RNA干扰抑制H3K9me3甲基化酶（Suv39h1/2）的表达,或通过过表达H3K9me3去甲基化酶（Kdm4b/d）,都可显著降低小鼠克隆胚胎中的H3K9me3水平,并将小鼠克隆胚胎发育至出生效率提高约9倍。但该方法是否也能提高猪克隆胚胎的发育效率未知。本项目的研究目的是利用RNA干扰和过表达方法建立基于抑制猪克隆胚胎的H3K9me3水平的高效猪体细胞克隆技术。 2、技术原理及性能指标：本项目通过RNA干扰供体细胞的H3K9me3甲基化酶SUV39H1和SUV39H2基因表达,将猪克隆胚胎的囊胚率显著提高1.63倍（11.46% VS.4.35%）,以及通过在猪克隆胚胎中过表达H3K9me3去甲基化酶KDM4B将猪克隆胚胎的囊胚细胞数显著提高24.14%（36±3.49 VS. 29±3.35）。 3. 技术的创造性与先进性：本项目建立的基于抑制猪克隆胚胎的H3K9me3水平的高效猪克隆新技术是在借鉴国外小鼠克隆研究的思路和方法基础上进行消化吸收创新。本项目建立的技术达到国内先进。 4. 技术的成熟程度,适用范围和安全性：本项目建立的技术已比较成熟,可以小范围应用,理论上安全性高。 5. 应用情况及存在的问题：本项目所建立的技术虽然可以显著提高猪克隆胚胎的体外发育效率,但能否提高猪克隆胚胎在体内发育至出生的效率仍需进一步研究。 6、本课题获得的主要成果： （1）获得的科技奖励： 主要由本项目团队完成的“种猪体细胞克隆技术研发与应用”项目于2016年获广东省科学技术奖一等奖。 （2）申请的相关专利： [1] 发明专利：一种基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法,专利号：201610117566.1,本项目团队成员为本专利主要发明人。 [2] 发明专利：一种克隆胚胎处理液及其使用方法以及该处理液的用途,专利号：201710339889.X,本项目团队成员为本专利主要发明人。 [3]发明专利：一种提高猪核移植效率的方法,专利号：201810561744.9,本项目团队成员为本专利主要发明人。 [4]实用新型专利：一种哺乳动物体细胞核移植重构胚融合装置,专利号：201820555089.1,本项目团队成员为本专利主要发明人。