[00135194]乙肝病毒毒株的新生物学特性与意义

1．发现抗原性与免疫原性相反的S(乙肝表面抗原)129L变异株。　　自母婴传播乙肝病毒(HBV)的小儿发现未曾报道过的在S基因“a”决定簇第129位氨基酸变异为亮氨酸(129L)。将变异的S片段克隆取代野毒株的S片段，转染细胞后，研究表达的HBsAg与24株单克隆抗体的结合力，发现129L与野毒株相比，对有的抗体结合力升高。然而当以带有129L的质粒DNA免疫两种不同品系的小鼠，动物的抗体应达显著较野毒株低下，鼠脾细胞在特异抗原诱生的干扰素也低下。为研究这一抗原性与免疫原性不同的现象是与氨基酸位置相关，还是与变异的氨基酸种类相关，组建了第129位氨基酸变为组氨酸的S基因片段(129H)克隆与129L比较，结果发现仅129L有此抗原性与免疫原性相反的新特性，说明与氨基酸种类相关。将129L作亲水、疏水性分析发现129L变异可导致疏水性上升，可能是导致免疫原性低下的原因。如被129L变异株感染，由于诱生免疫应答低下，则有利于病毒持续。为进一步了解129L是否广泛存在，对134例HBsAg携带者作筛查，发现了一例有129L变异。结果说明目前虽然129L变异株并未广泛传播，但其隐患值得注意。　　2．发现我国肝癌患者的HBV株复制性增强或较高。　　自一例由HBV携带者4年内发展成肝癌的患者血清、癌、及癌旁组织中扩增全HBV基因组，对比核苷酸序列、推导的氨基酸改变，虽然并无癌变后共有的特异变化，但X，S，C，Pre-S均1～5个氨基酸有变化。有意义的是用癌变前与后毒株全基因组转染细胞，癌变后的毒株显示复制性增强。进一步取6份HBV阳性肝癌组织，扩增全基因组，测序并转染细胞后作复制性研究，结果有5株HBV显示为高复制型。复制性增强将有利于子代产生对机体免疫系统逃逸的变异株，增强病毒蛋白的表达及其反式激活癌基因等的作用。由于在肝癌中发现2.2kb的双剪接体(double-spliced variant)比癌旁的比例为高，克隆了2.2kb的双剪接体，用其与全长毒株共转染细胞，发现此剪接体可增强全长毒株复制。这一增强机制，与剪接体中保留有完整的X阅读框架相关，可能是肝癌组织中HBV复制增强的机理之一。　　虽然过去普遍认为发生肝癌后HBV会停止复制，但本研究应用系列标本应用分子生物学技术显示在我国肝癌组织中病毒继续复制，不同于传统的概念。以后在台湾学者的流行病学研究中发现HBeAg阳性乙肝携带者发生肝癌的几率显著高于仅HBsAg阳性者。临床治疗中，也发现用干扰素治疗可降低肝癌的转移率，支持本研究的发现。　　3．对比临床高、低复制型毒株，发现HBV逆转录酶有一新的功能区，可作为新的抑制病毒复制的药靶。　　在乙肝患者中全基因扩增测序，发现有两株毒株分别为高复制株与低复制株，两株HBV均为B基因型，核苷酸序列同源性达98.7%。通过设计引物分别将病毒聚合酶的4个片段(末端蛋白，连接区，逆转录酶及RNAse H)进行互换，组成不同的嵌合体，分别转染细胞，对不同嵌合体分析病毒复制性，发现决定复制性高的片段位于逆转录酶区。进一步作点突变，确定是位于逆转录酶区第306位(rt306)氨基酸由脯氨酸变为丝氨酸所致。用计算机模拟三维结构分析，该氨基酸位于一螺旋钳结构的转角区。过去仅报道螺旋钳结构的alpha 螺旋可通过与DNA模板结合的牢度影响其功能，本研究首次揭示“转角”的氨基酸保守性也可影响病毒的复制。进一步研究发现HBVC基因型在该区也有同样功能。对rt 306周边氨基酸定点突变发现不仅限于一个氨基酸，是涉及9个氨基酸的域。为揭示造成复制变化的机理，经反式互补试验(transcomplementation)，发现这一功能区氨基酸变异可影响HBV核衣壳对病毒核酸的包装。这一发现过去未有报道。通过筛选小分子化合物库，已初步发现有体外抑制病毒复制的化合物。　　此外，还从经lamivudine治疗但病情恶化的4名患者，进行了治疗前后毒株的全基因克隆测序与在细胞中复制的研究，发现恶化后的病毒株复制性较未治疗前的毒株增加。在未出现核心启动子1762/1764双突变毒株的患者预后较好。