[00138320]黄芩苷抑制H22肝癌腹水移植瘤上皮间质转化的机制研究

一、项目来源： 甘肃省科技厅自然科学基金项目,2018年立项。 二、课题性质：本课题为甘肃省科技厅2018甘肃省创新基地和人才计划001048001,项目编号：18JR3RA073。 三、承担单位： 本课题由甘肃中医药大学附属医院承担,课题主持人：王宏伟,甘肃省科技厅下拨经费5.0万元。 四、研究目的和意义： 肝癌（liver cancer）是临床常见的恶性肿瘤之一。在全球范围来看,发病率呈现逐步上升态势,平均每年增加的患病人数已超过 62.6 万,在所有恶性肿瘤中居于第5 位;平均每年死亡人数接近 60万,在所有恶性肿瘤中相关死亡率居于第3位。目前,在我国肝癌呈现高发态势,我国的发病人数在全球范围内所占比例超过五成,加强对肝癌的研究力度,刻不容缓。原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,也是全球恶性肿瘤。目前,原发性肝癌的治疗策略包括化疗、肝动脉灌注化疗、手术及其他替代治疗方法。尽管在原发性肝癌的预防和治疗方面取得了一定进展,包括外科手术和辅助治疗措施的研究进展,原发性肝癌的预后并不理想。虽然近年来不断有化疗药物的更新换代及一些新的观念与治疗措施如术前新辅助化疗、术中化疗等出现,辅助治疗的效果并未出现根本性的改观,中晚期患者5年生存率并未得到明显改善。因此,更加深入的探索肝癌的发生发展机制以及探寻更加有效的治疗措施显得更为重要。而中医药治疗肿瘤的优势十分明显,例如,中医药可以减轻化疗的不良反应,延长肿瘤患者生存期等。中医药抗肿瘤可以通过调节免疫能、诱导肿瘤细胞凋亡、减轻血管生成和抑制侵袭转移来实现。肿瘤发生侵袭转移的第一步是局限性的侵袭,这需要原发肿瘤发生许多表型的改变,其中恶性肿瘤的上皮细胞向间质细胞转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）是引起肿瘤发生远处转移的关键步骤之一。正常上皮组织的多层细胞结构不利于恶性肿瘤细胞的运动和侵袭,为了获得运动和侵袭能力,肿瘤细胞必须丢失许多的上皮细胞的表型,使上皮层能够发生EMT。发生EMT的细胞,一方面失去了上皮细胞的典型形态,上皮细胞之间的相互作用消失,组织结构也相对松散,立方上皮细胞转变为纺锤形纤维细胞的形态,并且表现出侵袭性;另一方面,细胞的基因表达谱也发生改变,上皮细胞的标志性蛋白如E-cadherin表达下调,而间质细胞的标志蛋白如N-cadherin表达上调。恶性实体肿瘤中央的细胞为上皮细胞的表型,周围细胞常常会呈现间质细胞表型,因此周围细胞往往具有较强的运动能力而促使肿瘤细胞在局部产生浸润,并且侵入到血管和淋巴管进而转移至远处靶器官,随后恶性肿瘤的细胞可以发生间质细胞向上皮细胞转化（mesenchyma1-pithelial transitions, MET）来重建细胞之间的连接以及细胞骨架,从而形成转移灶。因此EMT是一个多步骤的动态的可逆的变化过程。肝癌侵袭、转移涉及细胞黏附、运动、增殖、细胞外基质的降解、机体免疫与肿瘤血管生成等环节,其分子机制主要有:与侵袭相关的抑癌基因的失活和癌基因的表达增加、与转移有关的细胞因子及其受体表达水平的变化、基质金属蛋白酶异常表达、肿瘤微血管密度的影响等。人们在原发性肝癌的细胞及动物模型、临床研究中发现了EMT现象,且EMT的发生与肝癌侵袭、转移密切相关。 五、研究结果： 本项目通过建立小鼠H22肝癌,而后采用黄芩苷分组干预。两周后取材,测定不同组别抑瘤率,运用实时定量PCR、免疫组化技术观察上皮间质转化相关的基因MMP2、MMP9、CDH1、CDH2、Vimentin、Slug和Twist1,探讨黄芩苷抑制上皮间质转化的机制。方法将60只昆明小鼠随机分为肿瘤模型组（模型组）、环磷酰胺对照组（环组）、黄芩苷低剂量组（黄低组）、黄芩苷中剂量组（黄中组）、黄芩苷高剂量组（黄高组）和黄芩苷中剂量联合环磷酰胺组（联合组）。接种 H22 肝癌细胞至小鼠皮下复制荷瘤模型后,分组给药连续14天。处死小鼠后,取瘤体、脾脏称重并计算抑瘤率和脾指数; 采用实时荧光定量 PCR 技术和免疫组化方法检测小鼠肿瘤组织MMP2、MMP9、CDH1、CDH2、Vimentin、Slug和Twist1的蛋白表达和mRNA表达。并检测NF-κBp65 的表达。结果发现：与模型组比较,黄中组、黄高组、联合组瘤体质量和脾脏质量下降,各给药组上皮间质转化标志物MMP2、MMP9、CDH1、CDH2、Vimentin、Slug和Twist1的mRNA和蛋白表达均降低（P＜0.05）,尤其联合组改变更加明显。因此,本研究发现黄芩苷可能通过调控NF-κBp65 信号通路来抑制肝癌荷瘤鼠肿瘤组织的增长,且与环磷酰胺联合用药作用更明显。本项目对中药及其有效成分抗肿瘤可运用先进的技术方法,多角度、多层次、多方面进行研究,以获得中药抗肿瘤治疗规律性的认识,提高中药研究的科学性、系统性,以便更好地服务于临床,以体现社会效益。