[00138404]禽流感与新城疫检测技术研究及应用

课题针对禽流感与新城疫两种疫病,建立了快速检测方法,构建了规模化鸡场疫病防控技术体系,为禽流感与新城疫检测提供技术支撑与物质保障。研究内容： （1）建立了AIV与NDV二重RT-PCR检测方法。根据GenBank登录的禽流感病毒（AIV）M1基因与新城疫病毒（NDV）M基因核苷酸序列,建立了AIV与NDV二重RT-PCR检测方法。该方法对AIV与NDV的最低核酸检出量分别为38pg与27pg,可同时扩增出 428bp（AIV）与297bp（NDV）的特异性片段,而对传染性法氏囊病毒等病原检测结果均为阴性。该方法可用于两种病毒病的临床快速检测与流行病学调查。基于此制定了“禽流感与新城疫二重RT-PCR检测方法”河北省地方标准。 （2）建立了NDV纳米PCR检测方法并组装了试剂盒。根据GenBank登录的新城疫病毒（NDV）M基因核苷酸序列,建立了NDV纳米PCR检测方法。该方法对NDV的最低核酸检出量为27pg,比传统PCR敏感10倍,可扩增出297bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒等病毒的检测结果均为阴性。该方法可用于新城疫病毒的临床快速检测与流行病学调查。创制了NDV 纳米PCR检测试剂盒,该试剂盒包括5×反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂、反转录引物、2×NanoPCR Mix、上下游引物。已申报国家发明专利并授权（专利号ZL201510077655.3）。 （3）建立了AIV实时荧光定量RT-PCR快速检测方法。靶向AIV的M1基因,优化反应体系与反应条件,建立了基于TaqMan的荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有较好的特异性与敏感性,最低能检测出3.2×10-4 ng/μL的病毒RNA。 （4）建立了AIV 通用型RT-LAMP快速检测方法并组装了试剂盒。基于M基因,建立了AIV 通用型RT-LAMP检测方法。该方法62℃反应60 min就可以判定结果,具有较好的特异性、可重复性和稳定性,能检测出的最低RNA浓度为0.004 pg。该方法适用于AIV基层或现场快速检测与筛查。创制了AIV RT-LAMP试剂盒,该试剂盒包括RT-LAMP反应液,Bst DNA 聚合酶,反转录酶,引物,荧光显色剂,阴阳性对照。已申报国家发明专利并授权（专利号：ZL201510077664.2）。该成果已经在河北省和全国部分地区进行了推广,取得了可观的经济和社会效益,为我国动物疫病防控工作做出了有益贡献。该方法可用于AIV感染的高通量快速检测与筛查。