[00138522]靶向HSV-2潜伏复发的microRNA的筛选及作用研究

单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-II）是人类疾病常见的病原体,在体内易引起持续潜伏感染,当免疫力低下时可反复被激活,难以治愈。病毒的潜伏感染是生殖器疱疹易复发、难根治的主要原因。目前有关的作用假说很多,但具体是哪一种作用机制尚不明确。潜伏相关转录体（LAT） 是HSV 在潜伏期间唯一大量表达和可以被检测到的基因组转录产物,在对HSV 的潜伏及再激活过程的研究中,学者们对LAT 的作用尤为关注。从上世纪70年代开始,学者们构建了许多LAT 突变株,用以研究LAT 在病毒潜伏及再激活中的作用。多种不同的假说被提出来,但争议很大,到目前为止LAT 确切的作用机制还不明确。主流的假说有两种,一是LAT 下调HSV 裂解基因的表达;二是LAT基因在宿主细胞通过抗凋亡使病毒能逃避宿主的免疫防御,达到潜伏感染的目的。三是LAT 基因编码的microRNA 通过调控自身基因和宿主细胞基因表达而以此调控HSV-2 在宿主细胞中存在的状态。 HSV-2 LAT 不编码蛋白,但编码多个 microRNA,后者可能在病毒潜伏感染神经元细胞中发挥作用。因此,我们提出LATs 介导 HSV-2 潜伏感染的新机制,即在病毒潜伏阶段,LAT 编码 microRNA 作用其靶基因,发挥 RNA干扰效应,进而抑制神经元细胞凋亡,使病毒持续潜伏感染。疱疹病毒编码的miRNA 已经被证实在病毒的潜伏感染和复制性感染过程中具有重要作用。而目前LAT 基因编码的microRNA 是否作于宿主细胞的相关报道较少。 本研究利用 HSV-2 microRNA 谱系分析,证明了前期关于RL1 具有抗细胞凋亡作用的结论正确,且与miR-H3 和miR-H4-5p密切相关;miR-H4-5p 可靶向作用于Hela 宿主细胞CDKN2A 和CDKL2 基因,并引起其mRNA和蛋白质水平的降低;miR-H4-5p 可通过靶向作用于CDKN2A 和CDKL2 基因发挥抗ActD 诱导的细胞凋亡作用,并促使细胞周期进入S 期,促进细胞增殖。此外,miR-H3 对细胞周期无明显作用;miR-H4-5p 可通过非经典方式与靶基因mRNA 互补结合,种子序列与mRNA 结合位点未完全互补。而miRNA 的5’端与mRNA 互补配对程度较高。这为研究 HSV-2 病毒潜伏、复发机制提供了一种新的思路,为生殖器疱疹治疗的新靶点提供更充分的实验依据和理论基础。 本项目1.研究了单纯疱疹病毒2 型潜伏相关转录体ORF1 的表达及其抗凋亡作用;2. 验证了单纯疱疹病毒2 型潜伏相关转录体RL1 的表达及其抗凋亡作用;3. 首次建立了放线菌素D 诱导非洲绿猴肾细胞（Vero）凋亡模型;4. 研究了单纯疱疹病毒2 型毒力蛋白ICP34.5 的真核表达及其对Vero 细胞活性的影响;5. 分析了单纯疱疹病毒2 型潜伏相关转录本开放读码框的表达及其抗凋亡功能;6.实验表明,miR-H4-5p 可通过靶向调节宿主细胞基因抑制细胞凋亡, 可能以此方式共同参与HSV- 2 潜伏感染的建立。 目前该课题共发表论10余篇,培养博士与硕士研究生4名,主编专著1部,参编1部。