[00138580]哺乳动物卵母细胞成熟、早期胚胎发育和胚胎干细胞的研究

依托本项目,我们研究成果为小鼠卵子和早期胚胎在发育过程中四个重要机理： 1、卵子和早期胚胎在成熟和发育过程中染色体的动力学调节机制,主要研究了酪氨酸蛋白激酶casein kinase 1 alpha （CK1α）调节染色体聚集和分离的机理。完成对CK1α分子的免疫荧光检测,对其在卵子成熟和克隆胚胎早期发育过程中的定位及其与纺锤体的关系进行详细探索。证明它与染色体聚集和分离有关,尤其是在克隆胚胎中它的严重缺失是导致克隆胚胎发育率低下的主要原因。进一步针对CK1α合成Morpholino,并利用特异性激活剂研究了它在过度激活状态下对卵子及胚胎发育的影响。结果表明CK1α在卵子和胚胎发育过程中具有时空表达特异性,干扰CK1α的功能会导致染色体分离、第一极体排放、中期板厚度等受到影响。该研究为人类生殖缺陷提供了基础数据,在《PLoS ONE》发表SCI论文一篇。 2、纺锤体组装解聚对卵子和早期胚胎发育的影响机制,主要研究了膜泡运输蛋白重链clathrin heavy chain 1（CLTC）调节纺锤体动态变化的机理。完成对CLTC分子的免疫荧光检测,对其在卵子成熟和克隆胚胎早期发育过程中的定位及其与纺锤体的关系进行详细探索。证明它与纺锤体形成有关,进一步针对CLTC合成siRNA,发现当CLTC的功能被干扰后,卵子及早期胚胎不能正常发育,根本原因在于CLTC功能的缺失破坏了纺锤体的正常形成,虽然染色体倍数没有受到影响,但纺锤体控制下的染色体分离受到严重干扰,探明了CLTC调控卵子及胚胎发育的分子机理。结果表明CLTC具有与纺锤体共定位的表达分布,敲减CLTC严重影响纺锤体的组装,进而影响卵子成熟和胚胎发育。该研究为克隆胚胎发育机理和染色体不均等分离提供了依据,在《Microscopy ＆ Microanalysis》发表SCI论文一篇。 3、系统研究了小鼠GV期卵子的卵丘细胞、透明带和带下间隙等形态对筛选优良发育潜能卵子的评价标准,发现卵丘细胞层数、透明带厚度和带下间隙宽度影响GV期卵子成熟率和早期胚胎发育率。为辅助生殖技术效率的提高提供了依据,在《PLoS ONE》发表SCI论文一篇。 4、建立一套高效的卵子冷冻保存技术,M199+20%NBS+10%EG+10%DMSO作为VS1, M199+20%NBS+20%EG+20%DMSO作为VS2时卵子的冻存效果最好。卵子在VS1中平衡2分钟,在VS2中平衡20秒钟或30秒钟时冷冻保护剂可以充分渗入细胞,且对细胞毒性较小;卵子在25℃环境中进行冷冻、在25℃或37℃环境中进行解冻时,冷冻保护剂对细胞的毒性较小并且可以充分渗入或渗出细胞,冻存效果最好。卵丘的存在对卵子的受精具有重要的作用,并可能在卵子的冻存过程中起有益作用。冻存后的卵子在受精液中恢复15-30分钟可能使它的细胞骨架恢复到正常形态,并能充分去除冷冻保护剂,提高其受精率和发育率。OPS法和尼龙环法均可用于冷冻昆明小鼠卵子,微滴法有待于进一步改进其操作方法。在《Scientific Reports》发表SCI论文一篇。